通过二次转化快速获得无筛选标记IGF-1/IGFBP-1叶绿体转基因生菜的研究

本研究旨在将胰岛素样生长因子-1（IGF-1）和胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）这两个具有重要功能的蛋白质因子转入生菜叶绿体，获得无筛选标记、高效表达的转基因生菜。.项目拟克隆生菜叶绿体rpoA基因两侧翼序列作重组片段，构建到aadA基因两端，转化生菜获得rpoA基因缺失白化体。构建新的表达载体，重组片段之间插入rpoA/IGF-1/IGFBP-1基因，片段外侧连接aphA-2（kan+）基因表达盒。转化上述白化体，瞬时表达Kan抗性，形成的愈伤组织转到不含抗生素的培养基上培养，获得无筛选标记并恢复绿色的转基因生菜。.研究将建立起新的叶绿体转基因筛选体系，即表型性状结合抗性对转化体进行筛选，实现快速同质化。IGF-1/IGFBP-1同时在植物体内表达，为将其用于基础研究和临床治疗提供理论依据。无筛选标记转基因植株的获得，有助于消除人们对转基因作物食用安全的担心。

胰岛素样生长因子1（IGF-1）是一种多功能细胞增殖调控因子，具有广泛的生物学效应，胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）通过与IGF-1的结合与释放，对IGF-1功能的发挥起着重要的调节作用。本研究旨在利用叶绿体能高效、安全表达外源蛋白的优势，在生菜叶绿体中表达IGF-1/IGFBP-1，以期为研究叶绿体表达系统并将其作为生物反应器生产IGF-1提供一种可能的途径。.项目主要进行了以下几个方面的研究工作：. 1、根据生菜叶绿体基因组序列，设计特异引物，PCR方法克隆了rpoA基因两侧翼片段作同源整合位点，构建了IGF-1/IGFBP-1叶绿体表达载体。对载体的有效性，进行了gfp基因原核表达验证。结果表明，gfp基因能够在质体特异性启动子Prrn及终止子TpsbA的调控下高效表达, 表达量约占总可溶性蛋白的45.6%，包涵体占菌体蛋白的47.5%。. 2、选择了22个品种的生菜，设计6-BA和NAA不同浓度组合，进行芽分化诱导培养，筛选出分化率高的品种，进一步作抗生素筛选培养，建立了Kan和aadA/spe两种生菜遗传转化筛选体系。. 3、进行了生菜核转化研究。以美国生菜“大速生”为试材，叶片为外植体，采用农杆菌介导法，将IGF-1基因成功导入生菜中。抗性芽进行4次连续筛选培养，获得的阳性植株进行了PCR及RT-PCR分子检测。结果15株抗性植株PCR检测，11株有目标条带。选取以PCR检测为阳性的植株进行RT-PCR检测，表明胰岛素生长因子-1在RNA水平上得到了表达。. 4、采用基因枪法进行了叶绿体转化研究。进行二次转化，第一次转化用pBaadA载体，采用30mg/L spe进行多轮筛选，筛选抗性转化体。第二次转化用pBrpoA-IGF-1/IGFBP-1载体，在含Kan 12 mg/L筛选培养基中进行筛选培养，形成的愈伤组织转到不含抗生素的培养基上进行培养。对部分转化植株进行了分子鉴定及表达产物检测，结果表明，生菜叶绿体中表达的IGF-1具有刺激成纤维细胞生长的活性。. 5、以本项目为研究内容，已毕业本科学生6名；毕业硕士研究生1名，另有2名在读。到台湾大学交流访问1人次。发表论文3篇，硕士论文1篇，已投稿3篇。.