CDKN2A基因影响磺脲类药物疗效的机制研究

Sulfonylurea is widely used to treat type 2 diabetes. Recently, it is reported that the CDKN2A gene may be associated with the efficacy of representative sulfonylurea-glibenclamide and beta cell function in population study. However, until now, there is no physiological or functional study focus on the mechanisms of this observation. So our research is going to explore the possible mechanisms in cell level. Modulation of CDKN2A levels in situ was enabled by small interfering RNA (SiRNA) and/or over expression lentivirus vector. We then evaluate its effect on insulin secretion under the stimulation of sulfonylureas in MIN6 cell lines. Also in MIN6 cell lines, we overexpress or silent CDKN2Agene, explore its influence on sulfonylurea receptor gene (KCNJ11 gene) and sulfonylurea carrier gene (OATP1B3gene) expression.In addition, we also evaluate the effect of different CDKN2A level on key metabolic enzyme (CYP2C9) in cultured mouse primary hepatocyte.From the above pharmacodynamic and Pharmacokinetic pathway, we would like to explore the molecular mechanism of CDKN2A gene and sulfonylureaefficacy in order to give evidence for new drug research development and individualized therapy in future.

磺脲类药物是临床上广泛使用治疗2型糖尿病的口服降糖药。近期针对磺脲类的药物遗传学研究发现CDKN2A基因和磺脲类药物的代表性药物--格列本脲的疗效以及β细胞功能相关，但具体机制不明。本课题拟通过细胞水平的机制研究探讨这种关联是否存在因果关系，并探索CDKN2A基因影响磺脲类药物疗效的分子机制。本课题通过SiRNA干扰技术沉默CDKN2A基因及通过构建腺病毒载体过表达CDKN2A基因，经转染胰岛细胞系MIN6细胞，研究CDKN2A基因低表达和过表达其对磺脲类所介导的胰岛素分泌的影响，以及对磺脲类受体KCNJ11基因和磺脲类转运子OATP1B3基因表达的影响。同时，在小鼠原代肝细胞中，研究CDKN2A基因低表达和过表达对磺脲类药物代谢关键酶CYP2C9的影响。从上述药效学和药代动力学的途径，探索CDKN2A基因影响磺脲类药物疗效的分子机制，为今后新药研发和指导个体化诊疗提供分子生物学的依据。

项目背景：本课题组在前期的药物遗传学研究中发现CDKN2A/2B 基因附近非编码区多态性与格列本脲的疗效相关。并且本实验室的数据以及国外生物信息学分析都证实CDKN2A 基因还和β细胞功能相关。但是否CDKN2A 基因确实能够影响格列苯脲的疗效，具体的影响机制如何，目前尚无报道。主要研究内容：本课题通过细胞水平的机制研究探讨这种关联是否存在因果关系，并探索CDKN2A基因影响磺脲类药物疗效的分子机制。培养小鼠来源的MIN6 细胞系和βTC-6细胞。在沉默CDKN2A 基因,以及过表达CDKN2A基因条件下,研究在高糖刺激或格列苯脲刺激条件下，MIN6细胞／βTC-6细胞胰岛素分泌的情况。重要结果和关键数据：在MIN6细胞系中建立了过表达CDKN2A基因的模型；在βTC-6细胞系中建立了过表达和低表达CDKN2A 基因的模型。分别测定细胞内的胰岛素和细胞外的胰岛素水平。发现各组细胞内胰岛素的浓度未见统计学差异。提示CDKN2A过表达不影响格列本脲刺激的胰岛素分泌。在低表达水平的CDKN2A基因的βTC-6细胞模型中，可以看到βTC-6细胞的胞内、胞外的胰岛素水平均未见统计学差异。提示DKN2A低表达不影响格列本脲刺激的胰岛素分泌。本研究同时从药效学和药代动力学的途径出发，探索CDKN2A基因影响磺脲类药物疗效的分子机制，但是并未发现CDKN2A基因对KCNJ11基因和INS基因表达的影响。科学意义：本课题在两种细胞系中，通过改变CDKN2A基因的表达水平，观察对格列本脲刺激胰岛素分泌的影响，但研究结果最终并未观察到CDKN2A基因的表达对细胞分泌以及合成胰岛素水平存在影响。提示既往人群水平所看到的关联并非因果关系。