泥鳅蛋白源抗ACE活性肽AHLL的吸收机制研究

Currently, hypertension is one of the world's deadliest diseases. More than 200 million Chinese people are facing the threat of hypertension and its complications. As a traditional food in China, loach with medical efficacy plays a positive role in adjuvant therapy of hypertension, anemia and cardiovascular diseases. On the basis of loach protein controllable enzymolysis and purification of angiotensin-Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptides,the absorption mechanism of tetrapeptide AHLL with the strongest activity will be studied through Caco-2 cell model in vitro in this project. The effects of time, concentration, temperature and pH on the uptake of AHLL are demonstrated，and the dependent factors are screened. It analyzes the efflux of AHLL widely and deeply with P-glycoprotein, metabolic enzyme CYP3A4 and apparent two-order kinetics model. The relationship between absorption and effllux is synthesized. It studies the transepithelial transport of AHLL definitely. At last, the absorption mechanism of AHLL is clarified. This is the first time to apply Caco-2 cell model to the absorption mechanism of loach angiotensin-Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptide. It will provide a theoretical basis for the development of functional loach foods with vital scientific significance.

高血压已是当前世界上死亡率最高的疾病之一，我国已超过2亿人正面临高血压及其并发症的威胁。泥鳅作为中国传统药食同源体，对高血压、贫血等心血管疾病都有辅助治疗作用。在泥鳅蛋白的定向酶解及抗ACE活性肽分离的基础上，本项目拟以抗ACE活性最高的四肽AHLL为研究对象，通过体外Caco-2模型，从细胞和分子水平上研究泥鳅蛋白源抗ACE活性肽AHLL的吸收机制：明确Caco-2细胞摄取AHLL的量效关系、时效关系、热效关系及pH的影响，筛选出细胞吸收的依赖因子；以P-糖蛋白、代谢酶（CYP3A4）及表观二级动力学模型多角度分析Caco-2细胞对AHLL的外排特性，弄清细胞摄取与外排的关联性；探明Caco-2细胞AHLL的跨膜转运方式，最终揭示AHLL的吸收机制。本项目首次将Caco-2细胞模型应用在泥鳅蛋白源抗ACE活性肽的吸收理论研究，为泥鳅功能性食品的开发提供理论依据，具有重要的科学意义。

泥鳅在中国有着悠久的食疗作用，经常食之可防血管硬化，对高血压、贫血等心血管疾病都有辅助治疗作用。前期研究中发现通过对泥鳅蛋白定向酶解，释放出优异的抗ACE活性肽段。经过超滤、凝胶过滤、反相高效液相色谱等技术分离制备出高活性的抗ACE活性四肽Ala-His-Leu-Leu（AHLL），该肽段为首次发现的抗ACE活性四肽。本项目以AHLL为研究对象，通过建立Caco-2细胞单层模型，系统地研究AHLL在细胞模型的转运特性和机制。探究AHLL在Caco-2细胞单层吸收的量效关系、时效关系、温度和pH对其吸收特性的影响，筛选出促进细胞吸收的依赖因子；利用外排蛋白P-糖蛋白及多药耐药蛋白（MRP）多角度分析Caco-2细胞对AHLL的外排特性，并探明吸收与外排之间的关系。结合Caco-2细胞AHLL的转运方式，最终揭示AHLL的肠细胞吸收机制。结果表明，当Caco-2细胞生长至第14天时，跨膜电阻值大于250 Ω•cm-2，模型具有良好的极性及通透性，倒置显微镜下可清楚地看见多个细胞间紧密连接。通过MTT法检测AHLL在Caco-2细胞转运的最大安全浓度为低于200 μg/ml。AHLL在Caco-2细胞的双向转运呈现时间和浓度依赖型，吸收90min时呈现平台。外排系数大于0.5，意味着主动运输和被动扩散同时存在。当温度从37℃降到4℃时，双向表观渗透系数显著降低。在生理pH条件下，AHLL的吸收显著高于其它pH值下的吸收量。p-糖蛋白和多药耐药蛋白对AHLL具有较强的外排作用，维拉帕米 和 MK571作为外排蛋白抑制剂，显著抑制AHLL的外排，证明该转运由p-糖蛋白和多药耐药蛋白（MRP）介导，尤其是MRP2转运蛋白。细胞旁路转运在Caco-2细胞单层的转运中占主导位置。研究结果首次将Caco-2细胞模型应用在泥鳅蛋白源抗ACE活性肽的吸收理论研究，为泥鳅降压功能性食品的开发提供理论依据，具有重要的科学意义。