纳米抗体复合物与特异性识别多肽的互作机制研究

Anti-immune-complex peptide can specially recognize the antigen-antibody complex to form a ternary complex, which is an effective way to achieve noncompetitive immunoassay for small molecular and it can result in significant improvement in sensitivity and specificity. But it’s difficult to obtain the targeted recognition peptide for specific antigen epitope of immune-complex, and the mechanism of anti-immune-complex peptide and antigen-antibody immune-complex is still unknown. This project intends to focus on the screen of recognition peptide and conformational analysis based on the unique structural properties of nanobody, which utilizes the conformational change of recognition part as target spot before and after its combination with small molecular antigen. Meanwhile the interaction mechanism of recognition peptide and immune-complex with the application of computer-assisted molecular modeling is also studied. For detail, we select small molecular compound 3-phenoxybenzoic acid (3-PBA) as the object which is a metabolic marker of pyrethroid insecticides. By preparing the nanobody and establishing phage peptide library, screening the phage peptide which specific recognizes the nanobody-based immune-complex, elucidating the interaction mechanism of nanobody-based immune-complex and the recognition peptide, improving the pertinency for peptide targeted screening with specific recognition of immune-complex and establishing high sensitive and high specific noncompetitive immunoassay.

抗免疫复合物多肽可特异性的识别抗原-抗体复合物，形成三元复合体，是实现对小分子非竞争免疫检测的有效途径，可极大的提高检测的灵敏度与特异性。但靶向识别免疫复合物特异性抗原表位的多肽较难获得，其与抗原-抗体免疫复合物的互作机制尚不清楚。本项目拟利用纳米抗体的独特结构性质，以其结合小分子抗原前后识别区域构象的变化为靶点，进行识别多肽的筛选与构象分析，辅助计算机分子模拟技术，进行识别多肽与免疫复合物互作机理的研究。项目以小分子拟除虫菊酯类杀虫剂代谢标志物3-phenoxybenzoic acid（3-PBA）为对象，制备纳米抗体和构建噬菌体展示多肽库，筛选特异性识别纳米抗体免疫复合物的噬菌体多肽，阐明纳米抗体免疫复合物与识别多肽的作用机制，提高靶向筛选特异性识别免疫复合物多肽的针对性，建立高灵敏、高特异性的非竞争免疫检测方法。

抗免疫复合物多肽可特异性识别抗原-抗体复合物，形成三元复合体，是实现小分子非竞争免疫检测的有效途径，可极大提高检测灵敏度与特异性。纳米抗体免疫复合物在结合/解离前后具有较大构象变化，有望提高抗免疫复合物多肽获取概率，弥补目前抗免疫复合物多肽材料筛选成功率较低的不足。此外，纳米抗体结构细微，更易形成致密的结合区域，能进一步提高非竞争免疫分析方法敏感性。. 本项目利用纳米抗体的独特结构性质，以其结合小分子抗原前后识别区域构象的变化为靶点，进行识别多肽的筛选与构象分析，辅助计算机分子模拟技术，进行识别多肽与免疫复合物互作机理的研究。研究内容包括纳米抗体的制备、多肽文库的构建、噬菌体抗免疫复合物多肽的筛选和识别机制的解析等。. 主要结果包括：（1）成功制备识别抗拟除虫菊酯代谢标志物3-PBA纳米抗体(VHH)，其IC50达2.3 ng/mL，与主要菊酯类农药无明显交叉，特异性较好。（2）成功构建噬菌体展示八肽文库，并结合商业化多肽库（NEB公司Ph.D.-7、Ph.D.-12和Ph.D.-C7C）用于亲和淘选，文库库容均超过109，多样性较好。（3）多组次淘选（淘选组>30），获取的噬菌体多肽克隆表现出仅识别VHH本身，而非免疫复合物。（4）计算机模拟对接结果显示小分子化合物完全包埋或陷入VHH结合口袋中，无侧链结构暴露，大大减少了溶剂可及表面积，导致抗免疫复合物多肽无法识别抗体和抗原的结合部位。（5）纳米抗体微小结构在荧光偏振免疫分析中，对方法敏感性无明显影响，VHH完全达到传统抗体在该体系中的分析性能。. 该项目为新型免疫分析材料创制及其分析方法应用评估的积极探索。研究表明纳米抗体和小分子抗原的结合模式对获取免疫复合物多肽影响较大，预先对免疫复合物结构进行解析，可降低后续抗免疫复合物多肽亲和淘选风险。纳米抗体微小结构在分子量敏感的免疫分析模式中非缺陷条件，可指导并推进纳米抗体在分析诊断领域的扩大化应用。