基于受激发射损耗的非线性结构光照明超分辨显微技术的研究

The understanding of the biological processes at the cellular and subcellular level requires the ability to directly visualize them. Fluorescence microscopy played a key role in biomedical imaging because of its high sensitivity and specificity. However, traditional fluorescence microscopy has a limited resolution of 200-250 nm due to optical diffraction. In recent years, various approaches have been developed to overcome the diffraction limit. Among these techniques, nonlinear structured illumination microscopy (SIM) has been demonstrated a fast and full field superresolution imaging tool, such as Saturated-SIM. However, due to the strong quenching effect from strong excitation, the application of Saturated-SIM has been limited..In this proposal, a new approach that applies nonlinear structured illumination by combining a uniform excitation field and a patterned stimulated emission depletion (STED) field is proposed. The nature of STED effect allows fast switching response, negligible stochastic noise during switching, low shot noise and theoretical unlimited resolution, which predicts STED-SIM to be a better nonlinear SIM. The invention of this new technique will break the diffraction limit and realize the full-field superresolution imaging on live sample and will provide a better tool for biology and medical research application.

由于光学衍射极限的存在，传统的荧光显微镜的分辨率通常被限制在200-300纳米。超分辨荧光显微镜既能实现纳米尺度的分辨率，又可以完成活体成像，为生命科学、医学领域的研究提供了重要的方法。非线性结构光照明显微成像是其中一种较有代表性的超分辨技术。但现已开发出的技术由于利用了激发饱和的非线性特性或是荧光激活开关的非线性特性，具有对荧光分子造成强猝灭或是对荧光分子的选择高要求的缺点，限制了该技术的应用。本项目拟利用受激发射损耗的强非线性特性，与结构光照明显微成像技术相结合，提出一种全新的超分辨显微技术：基于受激发射损耗的非线性结构光照明超分辨显微技术（STED-SIM）。通过开发基于非线性矩阵式结构光照明的新型算法，以及精密超分辨显微镜的设计与搭建，从而实现具有高分辨率、高成像速度以及大视野的超分辨成像技术。该技术将满足生命学、医学等前沿科学研究的迫切需求，实现光学超分辨显微领域突破。

荧光显微镜因特异性强、灵敏度高、可实现活体样本的实时动态成像等特点，在生命科学领域占据重要地位。然而，传统荧光显微镜的成像分辨率由于衍射极限的存在，可实现的最高分辨率受激发光的波长以及物镜的数值孔径所限制。近年来，涌现了多种突破衍射极限实现超分辨成像的显微技术。其中，具有成像速度快、成像视野大等优点的结构光照明显微镜(SIM)被认为是最适合应用于活体细胞实时动态成像的技术之一。然而，线性的SIM只能实现两倍成像分辨率的提升。本项目主要针对非线性SIM进行研究，提出一种基于受激发射损耗（STED）非线性效应的新型二维非线性SIM-Matrix-STED-SIM，采用矩阵式的结构光照明，利用干涉调制的结构化激发光照亮物体后再使用结构化的STED光对部分发射光进行淬灭，配合结构光照明算法从调制图像数据中解析空间频率领域的高频信息，进而重建出超分辨图像的超分辨显微镜。将可实现宽场成像的SIM技术与可提供快速的光子响应，理论上无限制的分辨率提升的STED非线性效应相结合，Matrix-STED-SIM 可实现大视野、高速、高分辨率的活体实时超分辨成像。通过理论研究和模拟仿真分析，验证了Matrix-STED-SIM可突破衍射极限分辨率实现超分辨成像，在同等噪声干扰情况下与使用均匀激发光场和结构化的STED光场的STED-SIM相比能够实现更高分辨率的成像，且所需的STED光强度更低，曝光时间更短，更适用于活体细胞的动态成像研究。