亚低温调节细胞自噬性死亡维持组织内稳态的神经保护作用及机制研究

The model of neuron mechanical injury in vitro and fluid percussion brain injury in rats will be used to observe the necroptosis in neurons, the signal transduction inside and outside neurons, the expression characteristic of autophagy-related genes and proteins after brain injury and treatment by different time course of moderate hypothermia. The functional behavior 、neuro-radiology、histopathology and outcome of the rats will be evaluated after brain injury and different treatment.The characteristic of release-signal transduction-autophagy- regulation of different transmitters in injury area and penumbral region after injury and treatments will be emphatically compared. Our research will not only expand a comprehensive knowledge on the molecular machanism of neuron autophagy after brain injury, but also elaborate the neuroprotection mechanism of moderate hypothermia mediated by the inhibition of autophagy and maitaining the tissue homeostasis. Our research will also open a new area on the inversion and therapy of cell death and have a great significance on the study of drug therapy and confirmation of new therapy target in brain injury.

本研究拟应用"体外神经元机械损伤模型"结合"大鼠液压颅脑伤模型"，动态观察细胞损伤后及在不同时程亚低温干预下神经元的自噬性细胞死亡发生情况、细胞内外信号转导、自噬性细胞死亡相关基因和蛋白表达等多个环节的不同特点；动态评估致伤动物不同时程亚低温治疗后功能行为学，神经影像学，病理组织学和预后变化，重点比较损伤中心区及损伤半影区及应用不同时程亚低温治疗后不同时间段各种递质释放－信号转导－细胞自噬性死亡调控环节的异同点。本研究不仅有利于拓展对颅脑创伤后神经元自噬性死亡发生的分子生物学机制的全新的认识和理解，从源头上阐明亚低温抑制自噬性细胞死亡、维持组织内稳态及启动内源性神经保护作用的机制，也为细胞死亡的逆转和治疗开创一个新的研究和应用途经，对颅脑创伤新靶点的确证以及治疗药物的研究有重要意义。

通过4年的研究，完成国家自然科学基金立项时的要求，培养博士研究生2名、发表本领域国际知名杂志（Journal of Neurotrauma 1篇, World Neurosurgery 2篇）论著3篇，主要研究结果如下：.一、亚低温对脑外伤之后皮层及海马CA1区细胞凋亡、自噬相关蛋白的影响.1.凋亡细胞指数结果：大脑皮层和海马：致伤后6h及24h在假损伤组中均未发现TUNEL染色阳性细胞。各时间点两组脑组织切片观察结果示在致伤后6h及24h，外伤组大脑皮层凋亡细胞指数明显增加，而在给予亚低温处理之后，凋亡细胞指数均显著下降。.2.大脑皮层及海马区域LC3及Beclin-1在致伤后6h及24h表达结果：致伤后TNG组各时间点大脑皮层LC3表达均较SNG组明显增加，在亚低温之后各时间点LC3表达进一步上调。.3.大脑皮层和海马6h及24h 各组Beclin-1，LC3及caspase-3表达结果 各组标本的蛋白表达数据均经过其β-actin标准化后获得。损伤后6h及24h均可看到自噬相关蛋白Beclin-1，LC3II表达增加，在亚低温之后自噬相关蛋白表达进一步上调。在24h自噬相关蛋白的表达较6h亦明显增加。而凋亡相关蛋白在亚低温之后大脑皮层区域的表达则明显下调。.4.LC3和Beclin-1在大脑皮层的表达分布 LC3在大脑皮层神经元及胶质细胞上均有表达。.5.自噬体在大脑皮层区域和海马的表达 SNG组自噬体表达较少。致伤后6h及24h均可以看到自噬体表达明显增多，且致伤后24h表达较6h显著增加；亚低温处理之后自噬体数目与TNG组自噬体数目相比明显增加。.二、 调控亚低温后自噬的表达对颅脑损伤后大鼠运动和记忆功能的影响.1. 横梁行走实验 3-MA组大鼠逃脱时间较Sham组及Saline组均明显延长。随伤后时间的推移，各组的大鼠逃脱时间均有所缩短，但3-MA组大鼠与其余两组大鼠之间的逃脱时间仍有明显差异，至伤后第五天， 3-MA组与其余两相比仍延长，差异仍有统计学差异。.2. 水迷宫实验 A．上台时间：Sham组大鼠与Saline组大鼠在伤后11-15d上台时间无明显统计学差异；而3-MA组大鼠致伤后11-15天的上台时间与其余两组之间存在明显差异，即各组大鼠在11d的上台时间均较后四次明显延长，而其余四次中上台时间逐渐减少。在第15d时3-MA组仍较其余组增加