GSK-3β调控端粒抑制自噬性细胞死亡保护肝IRI的机制研究

Hepatic ischemia reperfusion injury(IRI) is an important cause of hepatic failure after operation, an urgent problem in clinical is prevent and alleviate hepatic IRI effectively. Studies have suggested that GSK-3β is related to organ IRI closely. Autophagy is an adaptive response of cells to hepatic I/R, but excessive activation of autophagy can lead cells into the programmed death (autophagic cell death); Telomere protected by telomerase and its length determines cell aging and death. Our previous studies have found that GSK-3β phosphorylation increase tolerance to hepatic IRI, hepatic I/R result in inhibite of telomerase activity, Increase the severity of hepatic ischemia reperfusion injury. Therefore, we speculate that in hepatic I/R, GSK-3β phosphorylation is inhibited, so telomerase activaty decrise and telomere shortening, increase autophagic cell death and ultimately aggravate the hepatic IRI. However, Whether GSK-3β signaling regulates telomere and autophagy in hepatic I/R, the interaction and regulatory relationships between them in hepatic IRI that require further study. In this study, we start from GSK-3β, by use of molecular biology, morphology means, from the overall level, cellular level, molecular level to research, In vivo and in vitro to explore the pathogenesis of liver IRI. We will explore the mechanism of GSK-3β regulates telomerase, telomere, and autophagic cell death in liver IRI mechanism, in order to provide help for the protection and treatment of liver IRI by providing candidate molecules and new targets through our research.

肝IRI是导致术后肝功能衰竭的重要原因，有效预防和减轻肝IRI是临床急需解决的难题。研究认为GSK-3β与器官IRI密切相关；自噬是细胞对肝I/R的适应性反应，但过度激活自噬可以导致细胞进入程序性死亡（自噬性死亡）途径；端粒受端粒酶保护，其长度决定细胞衰老和死亡。我们前期研究发现GSK-3β磷酸化增加对肝IRI的耐受性，肝I/R后端粒酶抑制加重肝IRI。由此推测肝I/R后，抑制GSK-3β磷酸化，抑制端粒酶激活，端粒缩短, 增加自噬性细胞死亡,加重肝IRI。然而有关端粒酶、自噬是否受GSK-3β调控, 其相互调控关系致IRI加重机制需进一步研究。本研究拟以GSK-3β为切入点，应用分子生物学、形态学手段，从整体水平、细胞水平、分子水平、在体和离体方面探讨肝I/R后GSK-3β调控端粒酶及端粒，调控自噬性细胞死亡加重肝IRI的发生机制，旨在为预防和治疗肝IRI提供新的候选分子和作用靶点。

IRI发生的机制与氧自由基爆发、细胞内钙超载、炎症反应等有关。近期的研究表明细胞自噬也参与到IRI中，自噬体是细胞程序性死亡中分解老化、损伤细胞的主体。GSK-3β参与糖代谢、细胞的分化、增殖和死亡等重要生理过程。端粒存在于真核细胞生物的染色体末端，在细胞分裂过程中持续缩短，端粒DNA与端粒结合蛋白形成复合体，为染色体末端提供保护；端粒酶对于端粒的维持以及防止端粒丢失方面具有重要作用。端粒酶的活性主要取决于TERT，TERT可以提高DNA修复蛋白的表达，稳定染色体结构。GSK-3β信号通路参与了肝IRI的发生，通过调控端粒酶，影响端粒，进一步调控自噬性细胞死亡，参与了肝IRI的发生发展机制。为探索作用机制，本研究通过应用分子生物学、形态学等手段，从细胞水平、分子水平及在体和离体方面对肝I/R的发生发展机制做了初步探讨。通过构建外源端粒酶逆转录酶TERT基因导入及TERT基因沉默，制作肝细胞缺氧复氧模型和小鼠肝缺血再灌注损伤模型，进行细胞实验和动物实验。证实肝I/R后，激活PI3K/AKT/GSK-3β通路，p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达降低，炎性通路NF-κB激活，抑制端粒酶TERT激活, 自噬相关蛋白Beclin1、LC3I/II表达增加，自噬体增加，加重肝细胞凋亡。GSK-3β抑制剂通过降低炎性反应，p-p65、TNF-α、IL-1β等炎性因子降低，端粒酶TERT增加，减轻自噬和细胞凋亡, 减轻肝IRI。为了验证端粒酶和自噬的相互作用关系，我们制作了肝细胞TERT基因导入及TERTsiRNA基因沉默，得出结论：TERT基因导入后自噬和细胞凋亡降低，肝细胞IRI减轻；相反TERTsiRNA基因沉默后自噬和细胞凋亡增加，肝细胞IRI加重。综合上述结果，端粒酶活性增强能保护端粒，降低自噬和细胞凋亡，减轻肝缺血再灌注损伤，此通路是通过激活PI3K/AKT/GSK-3β通路实现的。本研究为探讨端粒酶及自噬在肝IRI的发生发展中的机制奠定了坚实的工作基础。项目资助发表论文4篇，待发表SCI2篇。培养在读硕士生3名，项目投入经费50万元，支出42.0366万元，各项支出基本与预算相符。剩余经费7.9634万元，剩余经费计划用于本项目研究后续支出。