RKIP介导的神经细胞自噬调节对脑卒中的保护作用及机制

Stroke has high morbidity and disability rate in China and seriously affects the quality of life and life span of patients. Our previous studies have shown that: 1) Raf kinase inhibitor protein (RKIP) has a significant protective effect on ischemic stroke; 2) RKIP attenuated the damage to nerve cells by oxygen glucose deprivation and blocked the activation of microglia. The protective effect of RKIP on nerve cells were mediated by inhibiting ERK and NF-κB activation. Interestingly, the protective effect of RKIP is better than the effect of the pathways inhibitors, which may suggest that RKIP plays a role in protecting nerves with multiple layers. Next we found that RKIP could interact with autophagy related protein LC3II which implied that RKIP may involve in the autophagy regulation. We speculated that RKIP might accelerate the clearance of intracellular autophagosomes accumulation and protect nerve cells. Based on our previous studies, we will use molecular and cellular biological approaches to investigate the how RKIP regulates autophagy in oxygen glucose deprivation cell model and rat ischemic MCAO stroke animal model. We will also explore the molecular mechanism how the interaction between RKIP and LC3 contribute to the regulation of autophagy pathway. In the present study, we can find out the key targets and mechanisms of the pathogenesis of stroke and provide new insights for the prevention and treatment of stroke.

脑卒中在我国发病率高、致残率高，严重影响患者的生活质量和寿命。我们前期研究发现：1）Raf激酶抑制蛋白（RKIP）对缺血性脑卒中有显著保护作用；2）RKIP通过调节ERK和NF-κB通路降低糖氧剥夺模型对神经细胞的损伤，同时可调节小胶质细胞的活化从而保护神经细胞。有趣的是RKIP的保护作用优于相关下游通路的抑制剂，提示RKIP很可能在多层面起到保护神经的作用。我们进而发现RKIP与自噬相关蛋白LC3II存在明显相互作用，推测其通过调节自噬流清除细胞内导致细胞死亡物质的积累从而保护神经细胞。本课题拟在前期研究基础上利用多种分子和细胞生物学技术，通过体外糖氧剥夺模型和大脑中动脉栓塞模型，探讨高表达RKIP对缺血性脑卒中的保护作用与调节神经细胞自噬之间的关系，揭示RKIP通过LC3分子自噬途径对缺血性脑卒中保护作用的分子机制。本研究可发现影响脑卒中发生发展的关键靶点，为脑卒中的防治提供新的思路。

本课题发现脑卒中过程中自噬对神经系统具有保护作用，且自噬的强度与RKIP呈正相关性。通过tMCAO模型模拟临床脑梗死的病理环境，给予RKIP干预后从梗死面积、神经电生理等多个维度进行药效学评价，从正反两个角度验证了RKIP对脑卒中过程中神经系统的保护作用；在体外进一步通过感染慢病毒和给予RKIP蛋白干预，验证了RKIP通过调控PI3K/AKT/mTOR通路引起自噬的分子机制。.RKIP蛋白通常表达于细胞质和质膜，针对RKIP靶点的配体开发有很好的科学意义和临床价值，我们发现了调控RKIP的活性天然产物-钩吻素子。该化合物来源于中药钩吻，具有良好的药效和生物安全性。钩吻素子可降低tMCAO小鼠的脑缺血再灌注损伤，对小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。钩吻素子的缺血保护作用与降低缺血再灌注引起的硝基化压力及后续神经元凋亡事件密切相关，并且钩吻素子能减轻缺血再灌注引起的神经元自噬，对神经元起到直接的保护作用。另外，钩吻素子能降低缺血再灌注中小胶质细胞和星形胶质细胞的增殖及活化，从而间接降低神经元的损伤。最后，我们还发现钩吻素子能改善缺血半暗区中血管完整性，对于后续脑功能恢复有着重要的价值。.在RKIP配体的发现过程中，我们进行了大量天然产物的筛选，发现了多个活性分子可调控RKIP的表达，通过影响PI3K/AKT/mTOR和NF-kB通路进而发挥生物学功能。其中孕烯醇酮可以对骨溶解具有良好的治疗效果；钩吻素子和钩吻绿碱对衰老相关疾病骨质疏松具有良好的治疗效果；特别地，钩吻素子能通过多种机制参与缺血再灌注损伤的保护，从而减轻缺血再灌注引起的损伤，同时可通过调控RKIP影响脑缺血过程中自噬的发生，减少低糖低氧环境下神经元细胞和小胶质细胞的凋亡率，是具有研究价值的抗脑卒中候选药物。