兔出血症病毒VLPs与HBGAs受体结合的分子基础研究

Rabbit haemorrhagic disease (RHD) is a highly contagious and acute fatal disease of the rabbit, caused by Rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV). VP60 protein is closely related to the immunogenicity and pathogenicity of RHDV. Studies revealed that RHDV use the carbohydrate moiety of host-cell histo-blood group antigens (HBGA) for attachment, initiating their replication cycle. In this project, immunoprecipitation of protease digested VP60 VLPs and construction of the specificity phage random peptide libraries were used to locate receptor binding sites on the VP60 protein. Then the potential receptor binding peptides will be synthesized and their binding ability to host cell and preventing RHDV binding with the HBGAs receptor will be analyzed. The potential receptor binding sequences mutant VLPs will be generated; the binding activity of natural VLPs and the mutant VLPs to HBGAs receptor, synthetic oligosaccharides and saliva samples will be analyzed. Our data will reveal the molecular base of RHDV binding to HBGAs receptor. It will be helpful for further understanding the molecular mechanism of infection and pathogenicity of RHDV.

兔出血症病毒（RHDV）是严重危害全球兔业生产的重要病原，衣壳蛋白VP60与病毒的免疫原性和致病性密切相关，研究发现VP60能够与病毒受体-组织血型抗原（HBGAs）相结合，启动病毒复制周期中的入胞环节。本项目着眼于受体HBGAs，利用VP60 VLPs，通过蛋白酶消化法和特异性噬菌体随机肽库法，筛选VP60与受体HBGAs结合的关键位点，并通过合成和标记多肽，阐明其与宿主细胞的结合活性及阻断病毒与受体结合的能力；此外，将潜在的受体结合位点进行突变，构建VP60 VLPs突变体，利用HBGAs结合和阻断试验，分析VP60 VLPs及其突变体与HBGAs的结合特性。综合解析RHDV与受体HBGAs结合的分子基础，为阐明病毒感染和致病机制提供理论基础。

兔出血症（RHD，Rabbit Hemorrhagic Disease）是由兔出血症病毒（RHDV，Rabbit Hemorrhagic Disease Virus）感染引起的一种高致病性和高死亡率的家兔疾病，死亡率达90%。RHDV能够吸附于成年兔呼吸道、消化道的上皮细胞上，与ABH组织血型抗原（HAGAs，Histo-blood group antigens）发生结合，从而启动病毒复制周期中的入胞环节。本研究利用H2型多糖阻断试验分析免疫血清对VP60 VLPs与受体HBGAs结合的阻断效应，结果显示，免疫后第7天至第240天的血清样品1:100稀释后，都能够有效阻断HBGAs与RHDV VLPs的结合，与PBS组相比差异显著。免疫后第7天血清的阻断率接近60%，第14天和第30天的阻断率分别接近75%和85%。第60天至第240天的血清样品几乎能够100%阻断HBGAs与RHDV VLPs的结合。本研究为进一步阐明RHDV与受体HBGAs结合的分子机制，通过构建RHDV VP60蛋白特异性噬菌体肽库，筛选RHDV VP60与受体HBGAs的结合域，所构建的多肽库滴度较高，且插入片段大小和位置都具有良好的随机性和多样性，进一步采用生物淘选和噬菌体原位杂交技术，筛选RHDV VP60与受体HBGAs的结合位点，同时将结合位点对应的碱基序列克隆表达，利用H2型多糖阻断试验进一步验证VP60与HBGAs受体的结合。最终筛选获得2个RHDV VP60与受体HBGAs的结合位点，分别为RFADIDHR (291-298aa)、VLQFWY(312-317aa) 。此外，本研究制备9株单克隆抗体，并对单抗进行了精确定位，鉴定获得3个B细胞表位，分别为N326PISQV331、D338MSFV342、K562STLVFNL569，其中326-331aa和338-342aa表位能够与受体HBGAs结合，表位所针对的单抗同样可阻断VP60与HBGAs的结合。上述结果揭示了病毒与受体HBGAs结合的分子基础，对阐述RHDV的感染和致病机制具有重要的意义。