楸树内生木霉中抗肝癌次生代谢物楸灵素的生物合成机制研究

楸灵素是上海交通大学植物生物技术中心首次分离获得楸树内生木霉(CCTCC M 208102)合成的次生代谢物,在细胞试验和动物试验中强烈的肝癌抑制能力,其抑癌能力相当于紫杉醇的10倍,但其生物合成的分子机制尚属于空白.本研究从楸灵素在不同条件下的诱导表达入手,采用突变体定位克隆、同源克隆、基因差异表达克隆以及文库克隆等手段，克隆楸灵素合成相关酶基因，通过突变体功能互补和体外酶催化试验验证克隆基因所编码酶蛋白的功能，揭示楸灵素的生物合成途径。在此基础上，研究诱导培养条件下楸灵素合成酶基因的表达谱及其变化规律，利用代谢网络分析技术确定楸灵素合成的关键酶，为通过代谢工程方法提高楸灵素含量提供理论基础。进一步尝试克隆楸灵素合成酶基因的启动子序列,采用酵母杂交等互作研究手段，研究诱导条件下调控楸灵素合成酶基因表达的调控因子,如转录因子等,阐明诱导培养提高楸灵素产量的分子机制。

楸灵素是内生真菌FSN002合成的一种具有强烈抗肝癌效果的一种含有萜单元的次生代谢物，本项目采用首先采用同源克隆技术，克隆了萜类单元公共前体IPP的5个合成酶基因，阐明了楸灵素中萜类单元的生物合成途径。通过合成动力学分析，发现楸灵素的合成主要发生在菌丝饱和期，显示出典型的次生代谢物生长生产分离特性。然后采用转录组测序技术，建立了内生真菌FSN002基因表达数据库，从中发现了17条在楸灵素高速合成期特异性高表达的基因序列；初步突变体功能验证，发现一个细胞色素P450基因和一个丝氨酸蛋白激酶基因参与了楸灵素的合成和调控，初步揭示了楸灵素生物合成和调控机制，为进一步全面阐明楸灵素的生物合成机制奠定了良好的基础。