高LET射线诱导肿瘤细胞自吞噬效应研究

在抗肿瘤药物和辐射诱导的自吞噬效应是促进还是抑制了肿瘤细胞死亡方面，目前的研究还存在矛盾之处，一方面在死亡细胞内发现自吞噬小体，并将这种细胞死亡方式命名为"第二类细胞程序性死亡"；但另外的研究结果显示抑制自吞噬又能促进药物或辐射诱导的细胞死亡。近来有实验证明高LET射线也能诱导细胞的自吞噬效应，但研究缺乏系统性。本项目采用不同传能线密度的重离子束辐照不同辐射敏感性的肿瘤细胞，通过自吞噬小体的测量，确定并系统性研究重离子诱导自吞噬效应随LET变化的规律；利用药物和siRNA手段抑制或者促进细胞中重离子诱导的自吞噬效应的产生，测量细胞活性以及克隆形成率的变化，确定自吞噬的产生在细胞重离子辐射敏感性变化中的作用。该项研究一方面是可以将自吞噬效应引入重离子生物效应的研究中，拓展研究方向；另一方面实验有明确的结论，就可以将自吞噬效应与重离子治疗相结合，使我国的重离子治疗技术迈上一个新台阶。

重离子治癌的蓬勃发展迫切需要我们对高LET射线与生物体尤其是肿瘤和癌旁组织的作用做深入的研究。自噬是以溶酶体为基础的细胞内降解途径，对于细胞内的物质和能量的平衡起着重要的作用。近来，在肿瘤治疗中，自噬作为一个重要的作用靶点，引起了相当多的关注。在本项研究中，我们分析了高LET射线诱导的肿瘤细胞中的自噬效应。用MDC和AO染色以及构建GFP-LC3质粒转染从形态学上分析了高LET射线诱导的自噬效应，发现高LET射线辐照后，在肿瘤细胞中有点状的MDC染色，橙色点状AO染色以及点状的GFP-LC3聚集。用western blot的方法分析发现高LET射线明显诱导了LC3II蛋白在三种肿瘤细胞系中的表达；用AO染色，结合流式细胞术的方法定量地分析了细胞自噬；用克隆存活的方法分析了细胞对高LET射线的辐射敏感性。发现用siRNA敲除细胞中的自噬关键基因或者用3甲基腺嘌呤（3-MA）处理细胞可以有效地抑制高LET射线诱导的自噬，进而降低细胞的克隆存活率。而用自噬诱导剂雷帕霉素和高LET射线联合处理细胞，增加肿瘤细胞的辐射抗性。Annexin V-PI染色和剪切的caspase-3等方法分析了细胞凋亡， 发现用自噬抑制剂3MA和高LET射线处理细胞明显增加细胞的凋亡，而用自噬促进剂雷帕霉素则抑制凋亡。以上的实验数据显示高LET辐照能够有效地诱导多种肿瘤细胞自噬的发生，细胞自噬水平随剂量和LET的增加而增加。自噬对于高LET射线来说是一个辐射抗性因素，抑制自噬可以明显的提高细胞的辐射敏感性和细胞凋亡。对于肿瘤治疗来说，高LET射线与自噬抑制剂相结合，有可能提供新型的肿瘤治疗方法。