腺苷酸活化蛋白激酶 (AMPK) 途径在温度应激影响多鳞白甲鱼脂肪酸代谢过程中的作用及机制分析

Temperature stress generally resulted in changes in energy banlance of fish. Adenosine monophosphateactivated protein kinase (AMPK) is sensitive to energy status change of fish and has proven to be a key enzyme on the regulation of fatty acid metabolism on mammals. Our hypothesis is that AMPK may play important role in the regulation of energy banlance of fish under temperature stress by regulating fatty acid metabolism. Our objective is to find out the effects of AMPK on the fatty acid metabolism of fish and the role of AMPK on fish temperature stress reaction specifically energy balance regulation. Largescale shoveljaw fish (Onychostoma macrolepis), which is an unique carp species in China, will serve as a model in this research. GC and HPLC will be applied to define fatty acid profiles and energy status in the blood and tissues of O. macrolepis under temperature stress. Realtime PCR, Western blot, inhibition of pathway and other biotechnological techniques will be used to detect the expression of certain genes and proteins involved in energy sensing and fatty acid metabolism of O. macrolepis under temperature stress. AMPK, and indicators of fatty acid metabolism including SREBP-1, FAS, ACC, CPT-1 and PPARα will be detected to confirm the molecular events on the pathway of fatty acid metabolism of O. macrolepis. This research will enrich our knowledge in mechanism of energy banlance regulation of fish under stress, and provide thoughts for establishing and optimizing strategies for enhacing the resistance of fish to temperature stress and minimizingthe negative effects on fish when a temperature stress event occur. This project has the significance of theory and application.

温度应激会导致机体能量平衡发生改变，而能量感知因子腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）可能通过调控机体脂肪酸代谢过程以维持机体在应激条件下的能量平衡。本项目拟以鲤科鱼类多鳞白甲鱼（Onychostoma macrolepis）为研究对象，运用气相和液相色谱技术检测温度应激条件下其血液和组织中游离脂肪酸和能量状态的变化，并采用实时定量PCR、Western blot、通路抑制等方法检测温度应激条件下多鳞白甲鱼能量感知和脂肪酸代谢相关基因和蛋白如AMPK、SREBP-1、FAS、ACC、CPT-1、PPARα等的表达变化，深入探讨温度应激影响多鳞白甲鱼脂肪酸合成和分解通路上发生的分子事件，系统分析AMPK在此过程中的作用及其机制。研究结果将丰富鱼类在应激条件下能量平衡机制的研究资料，有助于阐明鱼类对环境变温的适应机制，并为建立缓解温度应激对鱼类不利影响的方法提供参考，具有较大的理论价值和应用意义。

温度应激会导致鱼类能量平衡发生改变，直接影响其存活和生长，降低鱼类养殖经济效益，甚至可能造成巨大经济损失。本研究通过克隆获得多鳞白甲鱼AMPK家族基因和脂代谢相关基因的完整CDS，全面分析温度应激下多鳞白甲鱼血清和组织中的腺苷酸（ATP/AMP/ADP）水平、游离脂肪酸含量和脂肪酸组成，以及AMPK与其调控的脂肪酸代谢相关基因表达和酶活力的变化，系统研究温度胁迫下多鳞白甲鱼能量稳态及脂肪酸代谢的变化规律。重要结果如下：（1）通过克隆获得多鳞白甲鱼AMPK家族7个基因的完整CDS，其编码的氨基酸序列与其他鱼类甚至哺乳动物的同源性较高，功能结构域十分保守，亲缘关系与斑马鱼较为接近，其mRNA主要在能量代谢旺盛的组织中表达较高，如心脏、肝脏和肌肉等组织；（2）通过克隆获得多鳞白甲鱼SREBP-1和PPARα基因的完整CDS，其编码的氨基酸序列与鲤、金线鲃SREBP-1和PPARα具有高度同源性，功能结构域比较保守。 SREBP-1和PPARα mRNA在多鳞白甲鱼肝、肌和肠组织中表达较高；（3）高温和低温胁迫均可以激活多鳞白甲鱼AMPK，通过调控脂代谢相关基因表达促进肝脏和肌肉中脂质水解，释放游离脂肪酸，并增强β-氧化提供能量，但抑制脂肪酸合成，从而维持多鳞白甲鱼在温度应激下的能量平衡；（4）多鳞白甲鱼脂肪酸组成可以对温度应激作出适应性的改变，特别是低温应激下n-3 HUFA的比例升高，可能是优先被沉积在膜磷脂中，参与维持细胞膜的结构和流动性，保证其正常功能，避免低温应激的危害，而高温应激下MUFA和SFA的比例降低，这可能是由于优先被氧化供应能量；（5）高温应激下，多鳞白甲鱼在后期（48h）的脂质水解及脂肪酸β-氧化会减弱，这说明此时多鳞白甲鱼已经开始适应高温应激。然而，在低温应激下却未发现相同的趋势，表明鱼类应对高温和低温应激时的适应策略可能存在差异。本项目研究结果进一步阐明鱼类了对环境温度变化的适应机制，并为建立缓解温度应激对鱼类不利影响的方法提供了参考依据。