J亚群禽白血病病毒受体的鉴定及特性研究

ALV-J is different from other subgroup ALVs,it can not only.induce Chickens' tumor,but also can induce cancer of legehenne and chicken belong to localvariety.Although NHE1 has been idntified as a receptor for ALV-J,whether there exists another receptor for ALV-J 、how the virus initiate infection and what is the downstream pathway after virus entry into cells?These problems are still unclear. So this project is to express fusion protein which contain ALV-J envelope SU subunit and rabbit IgGFc,and catch the receptor through co-immunoprecipitations from susceptible cells and analyze by mass spectrum;and then amplify the gene of receptor by PCR and express on the surface of non-susceptible cells for reconstruction.After that,identify its specificity and ability of mediating infection.The results of this reserch will contribute to revealing the relationship between receptor and menbrane protein of virus and the virus pathogenesis.

J亚群禽白血病（ALV-J）不同于其他亚群的病毒，它不但引起肉鸡肿瘤，如今在我国还引起蛋鸡和地方品种鸡的肿瘤。尽管2006年国外鉴定出一种ALV-J受体NHE1，然而是否还存在其他的ALV-J受体？ALV-J如何启动感染？病毒进入细胞后的下游途径是什么？这些问题都不明确。所以本项目拟通过真核系统表达ALV-J env蛋白SU亚单位和兔IgGFc的融合蛋白，利用融合蛋白通过免疫共沉淀技术（CO-IP）捕捉易感细胞中ALV-J受体并进行质谱分析；PCR扩增可疑受体基因并在ALV-J非易感细胞中表达、重建受体蛋白，进一步通过免疫共沉淀试验和病毒感染试验鉴定受体的特异性和介导病毒感染的功能。研究结果将有助于揭示宿主细胞与病毒囊膜蛋白相互作用关系和致病机制。

J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J, ALV-J )是1980年代从肉鸡中首次分离鉴定。到目前为止，禽白血病病毒受体分离鉴定研究中，已有四种受体蛋白得到鉴定，分别是Tva, Tvb，Tvc和chNHE1。反转录病毒中被鉴定的病毒受体已有很多，如人免疫缺陷病毒利用CD4、CCR5和CXCR4分别作为主要受体和共受体感染人CD4 T细胞，较多的反转录病毒广泛地使用各种共受体分子介导病毒感染，这些病毒受体的鉴定为深入研究病毒感染机制和为人类控制疾病发挥了很好的作用。.本研究利用J亚群禽白血病病毒为模型，通过免疫共沉淀、质谱分析、荧光定量PCR等技术进行了ALV-J新受体的分离鉴定和特性分析。首先在腺病毒系统中成功表达了用于捕获病毒受体的诱饵蛋白，为下一步分离ALV-J受体提供了重要的物质基础。.同时利用DF1细胞和pcDNA-env DF1细胞系作为受体供体细胞，采用两种方案进行免疫共沉淀试验，SDS-PAGE和银染、切胶、质谱分析。经质谱测序获得两种膜蛋白，分别是78kd葡萄糖调节蛋白（GRP78）和 膜联蛋白A2（ANXA2），提示ANXA2和GRP78是ALV-J疑似受体。.为进一步鉴定ANXA2和GRP78，采用病毒感染抑制试验和RNA干扰鉴定GRP78和ANXA2对J亚群禽白血病病毒粒子进入靶细胞或在早期感染过程中是否发挥着受体的功能。通过IFA、WB、real-time PCR 、TCID50分别检测细胞中ALV-J env的表达水平，判定病毒感染抑制效果。结果显示，随着阻断抗体浓度的加大，DF1细胞中env蛋白越来越少，病毒滴度也显著降低，而对ALV-A的感染无任何抑制作用；RNAi试验结果与感染抑制试验结果一致。表明，GRP78和/或ANXA2的缺失导致ALV-J感染率的急剧下降甚至感染失败，表明GRP78和ANXA2是ALV-J的受体或共受体。.最后，本研究利用人胚肾细胞（HEK293T细胞）和鹅胚成纤维细胞（GEF）作为受体重建靶细胞，检测chGRP78和chANXA2是否具有介导ALV-J进入非易感细胞的功能。Real-time PCR结果显示，共表达chGRP78或chANXA2的293T细胞内env基因的相对表达水平相对空载体转染的293T细胞要高得多，说明ALV-J病毒粒子能够借助293T细胞表面