EV71病毒衣壳蛋白VP1基因的优化和免疫原性的研究

HFMD的主要病原体是EV71，感染性强、致病率高，感染引起重症病例的比例偏高。重症病例病情进展快，缺乏特异的治疗方法和有效的预防措施，易于致残或死亡，病死率可达10%～25%，严重影响儿童的身心健康。因此，研制有效的疫苗是预防和消除EV71感染亟待解决的问题。核酸疫苗是目前研究的热点，但其局限性在于抗原表达水平较低、免疫原性较弱。如何优化抗原基因,促进疫苗的表达和分泌，提高免疫原性，已成为构建和设计DNA疫苗的关键。本研究选择EV71 VP1基因，首先对其进行密码子优化并合成优化的VP1基因，在此基础上，以DNA疫苗为研究手段，设计和构建多种基因优化的VP1 DNA疫苗，通过VP1蛋白的表达和分泌，及动物免疫产生的抗体水平和体内外功能的鉴定，探索不同形式VP1的免疫原性强弱，并制备单克隆抗体，筛选EV71特异性抗原表位，为进一步研制新型DNA疫苗、防治和消除EV71感染创造条件。

本研究以DNA疫苗为研究工具，通过对肠道病毒71型衣壳蛋白VP1基因的优化， 改造基因表达的调控因素，促进目的基因在真核细胞的表达和分泌水平，提高VP1蛋白的免疫原性。.首先，为了使来自于病原体肠道病毒EV71的衣壳抗原VP1基因能够有效的利用真核细胞的转录和翻译系统，很好的在哺乳动物细胞内表达VP1蛋白，对VP1编码基因核苷酸序列按照哺乳动物细胞密码子的偏好性进行优化，并化学合成密码子优化的VP1基因。.其次，为了提高VP1基因在真核细胞的表达和分泌，通过引入信号肽序列、设计双聚体蛋白、以及联合IgG Fc等，共构建了五种密码子优化的VP1 DNA疫苗：VP1-opt，tPA-VP1，VP1-dimer，VP1-huFc和VP1-mFc。研究发现，tPA可以大大增加VP1蛋白的表达和细胞外分泌水平，免疫动物产生抗体的能力也较强。huFc可以进一步增强VP1蛋白的表达和分泌水平。VP1-dimer表达和分泌良好，但免疫动物时免疫原性并未得到提高。去糖基化试验表明，可能是二聚体形式的VP1蛋白不能正常糖基化，失去了表位空间构象所致。VP1-mFc的表达和分泌及其免疫原性均不理想。.文中构建的五种VP1 DNA疫苗在真核细胞表达的VP1蛋白可以被EV71感染的患者血清所识别，这为以后研发快速有效的EV71临床诊断试剂提供了实验依据，也为研制新型高效的EV71候选疫苗，进而防治EV71感染奠定基础。.本课题研究内容以第一作者发表SCI论文1篇，授权发明专利一项，另有一篇文章正在投递过程中。