B组柯萨奇病毒衣壳蛋白VP1核定位的生物学意义

Coxsackievirus B (CVB) is the major pathogen of viral myocarditis and dilated cardiomyopathy. The pathogenesis mechanism underlying CVB infection remains unclear. Some RNA viruses cause damages to the host cells by the active nuclear localization of their capsid proteins. Therefore, the nuclear localization of capsid proteins was one of the pathogenesis mechanisms for these viruses. We found that the capsid protein VP1 of CVB type 3 possessed a nuclear localization signal (NLS). In addition, other types of CVB had similar NLS sequences. We also observed that the nuclear localization of CVB VP1 disturbed the structure and function of the cells. Therefore, we hypothesized that the nuclear localization of VP1 may be one of the critical mechanisms for the damages to the host cells caused by CVB. VP1 nuclear localization may also be used by CVB to facilitate its own replication. This study aims to evaluate the effects of VP1 nuclear localization on the biology and pathogenicity of CVB: (1) Determine the NLS sequences of CVB VP1; (2) Determine the effects of VP1 nuclear localization on the biological properties of CVB by comparing the biosynthesis and replication of CVB protype and vairant with NLS-deficient VP1; (3) Determine the effects of VP1 nuclear localization on the pathogenicity of CVB by comparing the expression of VP1 and NLS-deficient VP1 in cells, and by compairing the consequences of the infections in cells and animals caused by CVB protype and by CVB vairant with NLS-deficient VP1. This study may recognize a new mechanism for CVB modulating and injuring host cells, and provide new molecular targets for the development of anti-CVB drugs.

B组柯萨奇病毒（CVB）是病毒性心肌炎、扩张型心肌病的主要病原，致病机制未阐明。某些RNA病毒衣壳蛋白可主动入核并损伤宿主细胞，是其致病机制之一。我们发现3型CVB衣壳蛋白VP1具有核定位信号（NLS），其他型别的VP1也有NLS相似序列，我们也发现VP1核定位可影响细胞的结构与功能，据此推测VP1核定位是CVB损伤宿主细胞以利自身复制的重要分子机制。本项目从三方向明确VP1核定位对CVB生物性状和致病性的作用：①确定CVB VP1的NLS序列；②对比CVB原型与VP1的NLS缺陷变异株的生物合成和复制，明确VP1核定位对CVB生物合成与复制等性状的影响；③对比原型和NLS缺陷型VP1对细胞的损伤作用，以及CVB原型和VP1 NLS缺陷型株对细胞和动物的致病差异，明确VP1核定位对CVB致病性的影响。本项目可能发现CVB调控和损伤宿主细胞的新机制，也为研发抗CVB药物提供新的分子靶点。

B 组柯萨奇病毒（Coxsackievirus B, CVB）为小RNA病毒科（Picornaviridae）肠道病毒(Entervirus)属成员，含6个血清型（CVB1-6），是病毒性心肌炎、扩张型心肌病的主要病原体。主要感染儿童和青少年，可导致严重并发症，目前无有效的药物和疫苗。CVB感染可以影响细胞的生物合成、细胞凋亡、细胞自噬、细胞天然免疫等生命活动，但CVB的致病机制尚未阐明。本课题研究了CVB衣壳蛋白VP1的核定位及其生物学意义。我们发现CVB3感染的细胞或细胞过表VP1时，VP1主要定位于细胞核。通过构建突变VP1的表达载体，证明VP1的核定位序列位于VP1的547–843nt，靠近VP1的C末端。将核定位序列中关键的氨基酸突变时，VP1失去其核定位的特性。过表达VP1或感染CVB3时，细胞周期停滞在G1期。同时，我们发现VP1可影响细胞周期调控蛋白的转录，其中p27、CDK4、CDK6的mRNA水平下降，而cyclin D、cyclin E、cyclin B、CDK1的转录水平升高。在蛋白水平上，VP1对细胞周期调控因子的影响表现为下调p57的表达。进一步研究发现，VP1对细胞周期的影响与CVB3感染对细胞的影响一致，即CVB3也通过影响细胞周期调控蛋白的表达，从而使细胞周期停滞在G1期，提示VP1参与了CVB对细胞周期的干扰。更重要的是，细胞周期的停滞促进了病毒复制。我们通过酵母双杂交实验研究了与VP1相互作用的宿主细胞蛋白，结果表明VP1与GOLGA2蛋白相互作用，这种相互作可能促进病毒复制。为了实时检测病毒感染，我们建立了基于肠道病毒3C蛋白酶及小动物成像技术的病毒感染检测方法。在研究CVB与细胞相互作用时，我们还发现非编码RNA对病毒复制的影响及病毒蛋白酶对CLCN7氯离子转运体的切割作用。我们的研究结果表明，CVB感染对细胞的影响是复杂的、多方面的，除了病毒蛋白酶对宿主细胞蛋白的剪切、关闭细胞的生物合成、干扰细胞自噬之外，CVB的核衣壳蛋白VP1也是病毒的致病因素之一，即VP1的核定位可以影响细胞的基因表达、干扰细胞周期，促进病毒复制。