Foxo3a-p53/MDM2负反馈弧通过PI3Kγ/AKT通路调控Kupffer细胞内毒素耐受的机制研究

Endotoxin tolerance of is closely related to the occurrence and development of clinical related diseases such as systemic inflammatory response syndrome. Previous studies of our group found that over expression of tumor necrosis factor (TNF) receptor-associated factor 3 (TRAF3) or inhibiting the ubiquitination of TRAF3 could not completely induce endotoxin tolerance in Kupffer cells (KCs). Recent reports showed that the phosphorylation of forkhead box protein O3（foxo3a）reduced the transcriptional activity of TLR4 by activating PI3Kγ/AKT pathway, however, the mechanisms are not clear. It is known that p53/murine double mimute (MDM2) can degrade the phosphorylation of foxo3a. Our preliminary experiment had the following results: foxo3a promoted the transcriptional activity of p53, p53 promoted PI3Kγ expression, and overexpression of foxo3a significantly reduced the apoptosis rate when a large dose of endotoxin was used in KCs. Therefore, we hypothesized that foxo3a-p53/MDM2 negative feedback loop may play a key role in the mechanism of PI3Kγ/AKT pathway in the regulation of the endotoxin tolerance in KCs. This study will choose KCs as target cells and foxo3a as the breakthrough point, regulate foxo3a expression of KCs in vivo and in vitro using gene knockout and other approaches, to investigate the mechanism of KCs endotoxin tolerance regulated by PI3Kγ/AKT pathway through foxo3a-p53/MDM2 negative feedback loop, and provide novel ideas for treating sepsis.

内毒素耐受与全身炎症反应综合征等危重症疾病密切相关。前期发现，过表达TRAF3或抑制其降解不能完全诱导TLR4信号所致的Kupffer细胞（KCs）内毒素耐受。据报道，叉头蛋白O3A（foxo3a）磷酸化会削弱PI3Kγ/AKT对TLR4的抑制，机制尚未清楚。课题组发现p53/鼠双微体蛋白2（MDM2）可降解磷酸化的foxo3a，foxo3a-p53-PI3Kγ是正向转录调控通路，且过表达foxo3a可显著降低内毒素刺激下KCs的凋亡。因此，推测foxo3a-p53/MDM2负反馈弧可能通过PI3Kγ/AKT调控KCs内毒素耐受的发生。本项目选择KCs为靶细胞，以foxo3a为切入点，建立体内外KCs内毒素耐受模型，通过基因敲除等方式改变KCs中foxo3a含量，探讨foxo3a-p53/MDM2负反馈弧通过PI3Kγ/AKT调控KCs内毒素耐受的确切机制，为脓毒症的治疗提供新的思路。

Kupffer细胞（KCs）内毒素耐受现象与全身炎症反应综合症等临床感染性疾病的发生密切相关。抑制巨噬细胞中核转录因子κB（NF-κB）的活性是诱导机体内毒素耐受最有效的方式之一。据报道，磷脂酰肌醇3-激酶γ（PI3Kγ）在受到脂多糖（LPS）刺激后，一方面能使Toll样受体4（TLR4）的亚细胞区室化，限制TLR4炎症信号传导，抑制促炎因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）的分泌以及增强抗炎因子如白介素10（IL-10）等的分泌，以抑制机体炎症反应。另一方面，PI3Kγ/AKT被激活后可直接磷酸化叉头蛋白O3a（Foxo3a），并通过p53-鼠双微体蛋白2（MDM2）泛素化水解Foxo3a，从而解除了Foxo3a对NF-κB活性的抑制作用，促进炎症信号的转导。上述两种相互矛盾的现象，提示PI3Kγ/AKT通路在调控内毒素炎症信号传导过程中可能受到来自下游Foxo3a和p53/MDM2通路的负反馈调节。但是，Foxo3a和p53/MDM通路在KCs内毒素耐受过程中存在何种相互作用关系，以及Foxo3a和p53/MDM通路是否是PI3Kγ/AKT通路调控KCs内毒素耐受的平衡机制，目前尚不清楚。因此，本实验将研究PI3Kγ/AKT、Foxo3a、p53/MDM在体内外KCs内毒素耐受模型的作用及相互作用的关系。结果发现：1. 过表达Foxo3a后可显著地抑制KCs中NF-κB的活性及炎症因子分泌水平，提高KCs对内毒素的耐受能力；2. 抑制PI3Kγ/AKT活性，可通过抑制Foxo3a磷酸化，增加Foxo3a蛋白表达水平，从而提高KCs和小鼠对内毒素耐受能力；3. Foxo3a-p53/MDM2形成的反馈弧是维持KCs中Foxo3a蛋白稳定的主要机制。此外，我们还发现抑制PI3Kγ/AKT磷酸化Foxo3a的作用或者阻断p53/MDM2泛素化降解Foxo3a，均可提高KCs和小鼠对内毒素的耐受能力。因此，本研究证实了PI3Kγ/AKT通路在调控小鼠体内外KCs的内毒素耐受过程受到p53-MDM2/Foxo3a负反馈弧的制约。这是我们首次观察到Foxo3a具有调控KCs内毒素耐受的现象，同时也初步阐明了PI3Kγ/AKT通路通过p53-MDM2/Foxo3a负反馈弧调控KCs内毒素耐受的分子机制。