黄芪酸性多糖通过DAF-16转录因子抑制秀丽线虫蛋白聚集毒性的作用机制研究

We have recently demonstrated that the acidic polysaccharide from Astragalus membranaceus (astragalan) is able to modulate aging and proteotoxic stress pathways in both human cells and C. elegans models. Astragalan not only reduces polyglutamine (polyQ) aggregation but also alleviates the associated neurotoxicity. It can also extend the adult lifespan of wild-type and polyQ C. elegans. Interestingly, although the effect of astragalan is independent of DAF-2/IGF-1R and AGE-1/IP3K but dependent on the DAF-16/FOXO transcription factor, a pivotal integrator of divergent signaling pathways related to both lifespan regulation and stress resistance. In this study we aim to examine the effect of other signaling cascades, such as AMPK, MAPK and SIR-2, as well as telomere and telomerase, upstream to DAF-16 on the neurotoxicity-suppressing and lifespan-extending activities of astragalan. Theses pathways will be explored in a range of transgenic and mutant C. elegans models using real-time PCR, Western and Southern blotting, RNAi and other molecular techniques. Revelation of the mechanism of action of astragalan will provide an important insight into the potential of polysaccharides and other glycotherapeutics in the prevention of proteotoxic disorders and promote more applications of the model animal C. elegans in the studies of traditional Chinese medicine.

我们前期工作发现黄芪酸性多糖能有效抑制多聚谷氨酰胺在人细胞和模式生物秀丽线虫内的聚集及神经毒性，同时还能延长多种亨廷顿疾病秀丽线虫模型的寿命。进一步研究显示，黄芪酸性多糖的这种作用与胰岛素信号通路下游的DAF-16/FOXO转录因直接相关但并不依赖上游的DAF-2/IGF-1R和AGE-1/PI3K。由于DAF-16是多个寿命和应激信号通路的重要整合因子，本项目拟在此基础上利用各种秀丽线虫转基因和突变模型，采用定量PCR、免疫印迹、RNA干扰等手段，探讨黄芪酸性多糖通过AMPK、MAPK和SIR-2等上游交叉信号通路以及端粒长短和端粒酶活性调控DAF-16从而延缓衰老和抑制蛋白聚集毒性的分子机理，为开发多糖类神经保护和神经退行性疾病药物提供药效物质理论基础，并进一步推动秀丽线虫模型在中药研发领域的应用。

本项目选择多聚谷氨酰胺（polyQ）转基因和相关信号通路秀丽线虫模型，针对DAF-16/FOXO上游调控通路如端粒相关通路以及AMPK、MAPK和SIR-2等途径，采用定量PCR、免疫印迹、RNA干扰等手段，探讨了黄芪酸性多糖调控DAF-16从而延缓衰老和抑制蛋白聚集毒性的分子机理，已按计划完成研究任务。主要包括：（1）采用Southern blot和TRAP-PCR-ELISA方法，发现黄芪酸性多糖对polyQ和野生型秀丽线虫端粒长度和端粒酶活性没有显著影响，说明端粒相关途径不是其发挥作用的主要通路。（2）通过寿命实验发现黄芪酸性多糖不能延长AMPK蛋白aak-2突变株的寿命，通过Western blot分析发现黄芪酸性多糖能提高野生型秀丽线虫AMPK磷酸化水平。同时，利用RNA干扰方法和药理学抑制剂实验，发现在AMPK受到抑制时黄芪酸性多糖不能缓解AM141秀丽线虫中的polyQ聚集和HA759秀丽线虫的ASH神经元死亡，也不能延长其寿命，而且对daf-16及其下游基因的表达水平也无明显调控。这些结果说明黄芪酸性多糖通过激活AMPK来调控DAF-16活性进而发挥其抗polyQ聚集及神经毒性的作用。（3）通过对MAPK信号通路的检测，发现黄芪酸性多糖能抑制AM141秀丽线虫中p38 MAPK的过度磷酸化，但其神经保护作用与p38抑制剂的作用并不叠加，说明其缓解polyQ聚集及神经毒性的作用与p38通路相关。（4）利用sir-2.1突变株VC199进行的寿命实验显示，黄芪酸性多糖不能延长VC199的寿命，而通过RNA干扰敲低sir-2.1后黄芪酸性多糖在AM141和HA759模型中仍能发挥神经保护作用，说明SIR-2途径不是其发挥作用的主要通路。（5）利用mRNA Seq和磷酸化蛋白分析技术检测了黄芪酸性多糖对polyQ秀丽线虫模型基因表达的影响，通过差异基因功能富集分析发现黄芪酸性多糖对蛋白代谢和磷酸化、MAPK、胰岛素、三羧酸循环等信号通路有调控作用，不仅验证了上述结果而且也为全面揭示黄芪酸性多糖的信号通路调控机制提供了依据。（6）利用上述polyQ和信号通路模型，发现部分其它中药多糖也具有缓解polyQ聚集毒性的神经保护作用。本项目的完成为开发多糖类神经保护和神经退行性疾病药物提供了药效物质理论基础，并进一步推动了秀丽线虫模型在中药和糖类药物领域的应用。