黄芪多糖抑制秀丽线虫多聚谷氨酰胺神经毒性的分子机理研究

前期结果表明，黄芪多糖不仅能抑制多聚谷氨酰胺(polyQ)在模式生物秀丽线虫体内的聚集及由聚集引起的神经毒性，还能延长多种亨廷顿等polyQ疾病秀丽线虫模型的平均寿命。本项目拟在此基础上，进一步以秀丽线虫为模型，探索黄芪多糖抑制polyQ毒性的分子机理。研究内容包括：通过体外及体内抗聚集和体内抗毒性试验鉴定黄芪多糖及其降解寡糖片段的活性；通过基因微阵分析得到黄芪活性多糖及寡糖作用的基因差异表达图谱，并用实时定量PCR进一步量化以获得黄芪多糖及寡糖作用于polyQ疾病的效应基因集；通过秀丽线虫信号转导模型比较分析黄芪活性多糖及寡糖作用的主要信号途径；采用专一性抑制剂和RNAi技术，结合免疫印迹、实时定量PCR、行为学等手段，进一步阐释主要信号途径与polyQ聚集及毒性的信号转导和基因调控机制。本项目将为开发黄芪多糖作为神经退行性疾病潜在药物提供理论基础，并为多糖类药物结构与功能关系的研究和功

本项目以模式生物秀丽线虫为模型，探索了黄芪多糖抑制多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集及聚集毒性的分子机理，已按计划完成研究任务。首先选择转基因秀丽线虫模型AM141，利用其体壁细胞中polyQ与黄色荧光蛋白相连的特点，通过观察荧光点数判断polyQ聚集状况。结果表明，黄芪多糖能明显减少polyQ聚集点的形成，从而证实其抑制polyQ在秀丽线虫体内聚集的作用。然后选择秀丽线虫ASH神经元polyQ毒性模型HA759，利用其ASH神经元随着个体发育和polyQ聚集而逐渐死亡的特点，通过与polyQ相连的绿色荧光蛋白判断ASH存活率。结果显示，黄芪多糖能显著抑制由polyQ聚集导致的ASH神经元死亡，从而证明其缓解polyQ聚集神经毒性的作用。寿命实验表明，黄芪多糖不仅能延长polyQ模型也能延长野生型秀丽线虫的寿命。基因微阵结果揭示，黄芪多糖对秀丽线虫中223个基因有上调而对176个基因有下调作用。在此基础上，选择与寿命调节、应激耐受和蛋白动态平衡相关的胰岛素信号通路（IIS）对黄芪多糖活性的分子机制做了进一步研究。利用IIS通路上、中、下游三个关键节点DAF-2/IGF-1R、AGE-1/PI3K和DAF-16/FOXO秀丽线虫突变模型进行的寿命实验显示，黄芪多糖能延长daf-2和age-1突变模型的寿命但不能延长daf-16突变模型的寿命，说明黄芪多糖的作用是非DAF-2和AGE-1依赖的但与DAF-16转录因子密切相关。利用实时荧光定量PCR方法对DAF-16下游部分基因进行的分析表明，黄芪多糖能显著上调野生型和polyQ模型秀丽线虫中scl-20基因的表达，但对daf-16突变模型的scl-20表达水平没有影响，说明黄芪多糖在DAF-16存在时可以对scl-20进行正常调节但在DAF-16缺失时无法进行该调节。此外，黄芪多糖对秀丽线虫DAF-16下游其它基因如dct-5、col-84、grd-4和spp-20也有不同程度的调控作用。利用上述polyQ神经毒性模型以及野生型和Aβ聚集毒性模型对黄芪寡糖进行的分析表明，本项目分离得到的黄芪寡糖OS1和OS2对秀丽线虫ASH神经元的保护作用不明显，但对三种秀丽线虫模型的平均寿命都有延长作用。本项目研究结果为开发黄芪活性多糖提供了理论基础，并为多糖类药物结构与功能关系的研究提供了秀丽线虫研究平台。