粗糙脉孢菌纤维二糖诱导纤维素酶表达信号传导通路中新元件CLP1分子功能解析

The cellulase signal transduction is still far from completely understood in filamentous fungi.Recently research on Neurospora crassa shown the cellobiose can induce the cellulase expression when two or three major b-glucosidases were deleted.Based on we have constructed the mutant of bg13 and bg123 system, in which the cellulases can be inducted efficiently and reproducibly by cellobiose. We found a novel protein(named as CLP1) has critical roles in the cellulases induction pathway, the deletion of CLP1 in bg123 background, the cellulases induction were significantly increased in both cellobiose and cellulose condition. Based on this finding, in this project,we will focus on functional characterization of CLP1 protein,including the roles of CLP1 in cellulses induction pathway, and the interactions between the CLP1 and the other known proteins of the pathways such as b-glucosidases and cellodextrin transporters.The characterization of CLP1 would definitely shed novle light on the mechanism of cellulases induction pathway and would also give the helps for industial cellulases production strain improvement.

近年来研究发现，纤维二糖可以稳定诱导粗糙脉孢菌纤维素酶表达，但诱导表达信号传导途径的核心基因元件大部分没有被克隆鉴定。近期我们发现在葡萄糖苷酶突变体背景下，进一步缺失一个新的蛋白（命名为CLP1蛋白）能够显著提高纤维二糖对纤维素酶的诱导。本申请将重点针对CLP1蛋白，利用粗糙脉孢菌完备的遗传操作系统，结合前期构建的纤维二糖稳定诱导纤维素酶体系，全面解析CLP1蛋白在纤维二糖诱导纤维素酶表达信号传导通路中的分子功能。将构建CLP1与该通路已知元件葡萄糖苷酶和纤维二糖转运蛋白组合突变体，分析这一系列突变体的纤维素酶诱导表达状况，从而解析CLP1与葡萄糖苷酶、纤维二糖转运蛋白CDT1、CDT2在这一过程中的相互作用等。CLP1蛋白，作为粗糙脉孢菌纤维素酶诱导表达信号传导通路中新元件，其分子功能的解析，对阐明整个纤维素酶信号传导途径的分子机理和提高纤维素酶工业菌种发酵水平都有重要意义。

本课题以模式纤维素降解真菌粗糙脉孢菌为研究对象，重点研究纤维二糖诱导纤维素酶信号传导途径分子机理，尤其是新发现的重要元件CLP1蛋白功能，以及CLP1 与该信号传导途径其他重要元件纤维二糖转运蛋白CDT1/CDT2和葡萄糖苷酶等之间的协同作用。课题已经按照计划，通过构建葡萄糖苷酶、纤维二糖转运蛋白和CLP1 基因系列组合突变体，详细分析了组合突变体纤维二糖转运，纤维素酶诱导表达和生物量等性状，并结合转录组分析，系统研究了CLP1在纤维二糖诱导纤维素酶途径中的分子功能。结果发现，在 BG123 敲除背景下，进一步敲除CLP1，能够显著提高纤维素酶的诱导水平，但进一步分析表明 CLP1 蛋白作为纤维二糖转运蛋白的类似蛋白，具有转运蛋白特征却没有转运能力，因此CLP1 蛋白是通过间接影响纤维二糖分子转运，或者直接参与感受传递纤维二糖分子信号来发挥作用。随后，通过分析组合突变体纤维二糖转运能力和转运蛋白表达，发现在葡萄糖苷酶三缺突变体背景下，缺失CLP1可以显著提升CDT1 的表达，进而提升纤维二糖的转运，从而提升胞内纤维素酶的表达，较为清晰的揭示了CLP1 和葡萄糖苷酶及纤维二糖转运蛋白之间的协同关系。. 另外，围绕丝状真菌纤维二糖诱导纤维素酶表达信号传导途径，课题组成员挖掘了参与这一途径新的蛋白元件，包括细胞壁蛋白NCW-1，以及参与上游调控的激酶STK12，转录调控因子CLR4等。为了进一步改造重构纤维素酶诱导途径，课题组还成功研发了基于CRISPR的丝状真菌基因组编辑技术，并显著提升了工业丝状真菌纤维素酶表达。课题执行过程中，相关研究结果发表SCI 文章7篇，申请专利3项，培养博士生3名，硕士研究生5名。总体上出色完成了课题任务。