利用插入性突变体研究Sox21基因在斑马鱼神经发育中的功能

B1族Sox基因Sox1-3在胚胎发育中扮演了重要角色，B2族的Sox21被认为发挥着拮抗B1族的作用，但由于没有遗传突变体，目前对其功能所知甚少。斑马鱼有两个Sox21（sox21a和sox21b）基因，我们在前期工作中获得了一个sox21a的插入性突变体，并通过初步检查发现纯合子鱼侧线发育异常。胚胎原位杂交实验表明两个基因一方面单独表达于侧线、视顶盖和鼻，另一方面重叠表达于神经管、内耳和下丘脑，提示部分功能冗余。据此，我们拟：1）对sox21a插入性突变体进行更加全面和细致的检查，2）在sox21a突变的基础上敲低sox21b的表达，3）进行条件性过表达实验，从功能缺失和功能获得两方面分析Sox21基因对斑马鱼神经发育的影响，重点关注神经管、内耳和侧线，并初步分析视顶盖、下丘脑和鼻。以上研究旨在揭示Sox21在脊椎动物神经发育中的功能，并为深入了解B族Sox基因的功能和调控提供基础。

我们利用前期发现的sox21a突变体开展了对Sox21基因功能和调控的研究。在功能分析方面，我们首先根据研究计划对sox21a插入性突变体和sox21b基因敲低鱼胚的表型进行全面、细致和重复多次地分析，但未能发现异常生物学表型。鉴于此，为了寻找Sox21基因功能的线索，我们对sox21a插入性突变体的侧线神经丘进行了转录组分析。在成功建立单个侧线神经丘转录组分析技术后，我们共检测四个侧线神经丘，其中纯合子和杂合子各两个。结果显示我们的数据真实反映了侧线神经丘的转录组，并在转录组水平证实转座子插入完全破坏了sox21a的转录本。比较纯合子与杂合子的转录组，我们共发现54个在二者之间有表达差异的基因，其中52个在纯合子中表达水平下调，2个表达上调，这提示sox21a缺失主要导致基因表达水平下调。我们对这些基因进行了生物信息学分析，结果显示，1）它们中有一些可能参与毛细胞终末分化和功能的基因；2）没有已知的参与侧线或毛细胞发育的重要信号蛋白和转录因子，提示sox21a可能主要影响了毛细胞的终末分化和功能。在另一方面，我们分析了Sox21基因的转录调控。我们比较分析了sox21基因区域的高度保守非编码元件（CNEs），有趣的是，16个泛脊椎动物CNEs都不对称地保留在sox21b区域，而sox21a区域仅保留了2个鱼类特异CNEs。转基因分析发现6个sox21b CNEs和2个sox21a CNEs具有增强子活性，并且分别对应各自基因的表达图式，提示两个sox21基因通过各自丢失了部分转录调控元件而发生功能分工演化。值得一提的是，sox21a区域的Aup1元件是首次报道的神经丘增强子。综上所述，本研究对斑马鱼sox21a和sox21b基因的表达、调控和功能进行了细致地分析，并全面分析了sox21a插入性突变体神经丘的转录组。表型分析和转录组数据显示sox21a缺失未影响已知参与侧线和毛细胞发育的关键基因，但提示毛细胞的分化和功能可能受到影响。在转录调控研究方面，我们发现了8个位于sox21基因区域的高度保守转录调控元件，其中一个元件为首次报道的侧线神经丘增强子。