基于AMPK信号通路探究肺瘤平膏调控自噬重塑肿瘤微环境影响肺癌进展及化疗耐药的效应机制

Cell autophagy is involved in remodeling tumor microenvironment and influencing tumor progression and chemoresistance. AMPK is a key target of autophagy and inflammation, activation of AMPK can inhibit mTOR, induces cell autophagy and affect treatment of lung cancer. In this study, based on our previous results, we will establish a lung adenocarcinoma model and a chemoresistance animal model to explore the mechanism of Fei-Liu-Ping ointment regulating AMPK-mTOR signal to treat lung cancer; For the in vitro study, Construction of co- culture system to simulate tumor inflammatory microenvironment and then to explore the effect of FLP serum on activation of AMPK to affect lung cancer cells proliferation and apoptosis, and the effect of FLP serum regulation antophagy on chemoresistance. Multiple molecular methods will be used to detect antophagy relative protein, AMPK targets protein, such as mTOR, p70s6kinase, 4EBP1 and ULK1, and apoptotic protein and relative inflammatory cytokines. Furthermore, to inhibit AMPK signal pathway to systematicly explore the effect of regulation of autophagy by FLP on reshaping tumor microenvironment and chemoresistance and to indicate the mechanisms of the prescriptions with Fu-Zheng-Jie-Du role on antophagy and lung cancer treatment.

细胞自噬参与重塑肿瘤微环境并影响肿瘤疾病进展和化疗耐药。AMPK是关联自噬与炎症的关键靶点，激活AMPK可抑制mTOR,诱导细胞自噬发生而影响肺癌防治。基于扶正解毒活血中药肺瘤平膏调控肿瘤炎性微环境抑制肺癌的前期积累, 本研究拟建立肺癌荷瘤模型和化疗耐药荷瘤模型，动态探究肺瘤平膏调控自噬信号AMPK-mTOR防治肺癌的效应机制；体外构建共培养体系模拟肿瘤炎性微环境探究肺瘤平膏含药血清激活AMPK调控自噬对肺癌细胞增殖凋亡的影响；并对其调控自噬影响化疗耐药机制予以探究。通过对自噬关键蛋白及AMPK调控的mTOR、p70s6kinase、4EBP1、ULK1等蛋白进行检测；对相关增殖凋亡蛋白及炎性因子进行检测；并进一步阻断AMPK信号通路关键蛋白，系统探究肺瘤平膏调控自噬重塑肿瘤微环境对肺癌防治及化疗耐药的影响，以期揭示扶正解毒法指导的中药调控自噬防治肺癌的效应机制。

肺癌是全球癌症死亡的主要原因，化疗是治疗肿瘤和防止肿瘤术后复发转移不可替代的常用的治疗手段之一，但是在治疗过程中出现肿瘤细胞的耐药常常导致化疗的失败。近年来研究发现，自噬可以用来帮助肿瘤细胞逃避放化疗或者其他治疗介导的细胞死亡。肺瘤平膏（FLP）是治疗肺癌的有效方剂。本研究通过观察FLP对肺癌小鼠及肺癌化疗耐药荷瘤动物模型中肿瘤组织及A549/cis肺腺癌耐药细胞株中耐药蛋白表达的影响，从自噬的角度揭示FLP抑制肺癌生长及逆转化疗耐药的分子机制。A549肺癌荷瘤小鼠实验表明：FLP可以抑制A549荷瘤小鼠肿瘤组织的生长，并且随着干预时间的延长抑瘤率逐渐增加，FLP可以上调A549荷瘤小鼠肿瘤组织的自噬相关蛋白LC3II/LC3I、ULK1、P-ULK1、Belin1、ATG3、ATG5和ATG7的表达，FLP能够通过上调AMPK信号通路，促进凋亡蛋白Cleaved Caspase-3表达，抑制凋亡抑制蛋白XIAP、Survivin表达，从而促进细胞凋亡，阻滞细胞周期。体外共培养模型中，FLP含药血清可以上调自噬相关蛋白LC3II/LC3I比值、P-ULK1和ATG3的表达，上调AMPK信号通路活性，抑制mTOR信号通路活性，改善肿瘤微环境中的炎性状态，细胞上清液炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6水平。在A549/cis肺癌化疗耐药荷瘤动物模型中，FLP与顺铂（DDP）联用，能有效地抑制肿瘤生长，能有效抑制肿瘤组织中Ki-67的表达，能明显降低MDR1的表达，能一定程度增加Atg3、Atg5和Atg7的表达，同时能降低p62的表达，能一定程度诱导自噬，抑制AMPK/mTOR信号通路；FLP联合化疗药DDP在体外能够有效地抑制A549/cis耐药株地增长，能够有效地促进A549/cis耐药株的凋亡，能够有效抑制MDR1的表达，但对MRP1表达的影响不明显，能够抑制自噬的标志物LC3II/LCI的表达，增强P62的表达，同时不同程度地抑制自噬相关蛋白Atg3和Atg7的表达，还能降低Beclin1的表达，能够明显抑制AMPK/mTOR信号通路。因此，FLP与DDP联用能够有效地抑制A549及A549/cis耐药荷瘤小鼠肿瘤的生长和增殖，且FLP与DDP联用可以通过抑制自噬降低耐药相关蛋白的表达，增加DDP的敏感性，逆转耐药。