应用组织透明化技术研究小鼠视网膜小胶质细胞发育及其在视网膜色素变性中的作用

Retinitis pigmentosa refers to an inherited retinal degeneration, and characterized by the gradual onset of blindness due to progressive photoreceptor cells death. Currently there is no effective therapy. Other studies showed that microglia play an important role in this disease, but with limited knowledge of its mechanism. Monocytes typically do not cross the blood-retina barrier in the healthy retina, but will invade retina when this barrier is damaged. It is still unknown that how these invaded monocytes interact with microglia in the progress of photoreceptor cells death. In present study, our group has made the embryo and eyeball of rodents fully "CLEAR", which allowing embryo and eyeball 3D reconstruction without the need for ultra thin physical sectioning and can map the architecture of retina, this novel technique will help to observe the development of microglia in Ccr2-RFP Cx3cr1-GFP mice model. We will also research the function of microglia in photoreceptor cells damaging by selectively injection with macrophage cells depletion reagent and neuroprotective reagent. For this study, we try to elucidate the function of microglia in retinitis pigmentosa, and the therapy target of the neuroprotective reagent. Furthermore, this study will provide a clue helping to explore a new treatment method in either system or topical for retinitis pigmentosa.

视网膜色素变性是常见的致盲性遗传疾病，以感光细胞进行性凋亡为特征，迄今尚无有效治疗方法。研究发现小胶质细胞在该感光细胞凋亡病理过程中发挥重要作用，但是确切机制未明；此外，正常人血液中的单核细胞基本不侵入视网膜，而在疾病中血-视网膜屏障被破坏，单核细胞侵入后是否协同小胶质细胞产生损伤或保护作用，目前也属未知。本研究拟在课题组已实现的鼠胚胎与眼球透明化的前期基础上，结合前期已经培育的表达Ccr2-RFP Cx3cr1-GFP荧光蛋白视网膜色素变性小鼠，实现全胚胎及全眼球水平三维高分辨率成像和视网膜细胞的空间三维投射，研究视网膜小胶质细胞的发育；同时对正常和疾病小鼠注射氯膦酸二钠脂质体，选择性地清除视网膜小胶质细胞或血液单核细胞，并联合视网膜保护剂的应用，研究感光细胞损伤情况的变化。最终阐明小胶质细胞在该病中作用，以及保护剂作用的靶细胞。本研究结果将为该病的局部和全身治疗提供有力的实验基础。

视网膜色素变性是常见的致盲性遗传疾病，以感光细胞进行性凋亡为特征，迄今尚无有效治疗方法。研究发现小胶质细胞在该感光细胞凋亡病理过程中发挥重要作用，但是确切机制未明；此外，正常人血液中的单核细胞基本不侵入视网膜，而在疾病中血-视网膜屏障被破坏，单核细胞侵入后是否协同小胶质细胞产生损伤或保护作用，目前也属未知。本研究拟利用组织透明化技术，实现全胚胎及全眼球水平三维高分辨率成像和视网膜细胞的空间三维投射，研究表达Ccr2-RFPCx3cr1-GFP荧光蛋白视网膜色素变性小鼠眼中视网膜小胶质细胞的发育；同时对正常和疾病小鼠注射氯膦酸二钠脂质体，选择性地清除视网膜小胶质细胞或血液单核细胞，并联合视网膜保护剂的应用，研究感光细胞损伤情况的变化。最终阐明小胶质细胞在该病中作用，以及保护剂作用的靶细胞。本研究结果将为该病的局部和全身治疗提供有力的实验基础。在研究中，我们优化和改良了小鼠眼与胚胎透明化方法，形成了一套有效的小鼠眼和胚胎眼透明化、染色和成像的实验流程与条件，可以减少眼球组织的形变，缩短眼组织透明化的时间。透明化技术虽然耗时较长，但操作流程相对简便，可以保留组织结构的完整性，成像深度深，在全眼球组织学研究领域有较好的应用前景。但在进行基因鼠建模时，涉及到多对基因的动物模型通过自然杂交方式获得率低，耗时冗长，需要进一步的繁殖培育。