Smac对晶状体上皮细胞死亡方式的影响及其在白内障发病机制中的作用

Cataract is the world's first eye disease causes blindness up. It was thought that the apoptosis of lens epithelial cell apoptosis may be a pathological basis of all kinds of congenital cataract. We found in our previous studies that there are three death ways of LECs,inlcuding apoptosis,bige and vice apoptosis, in the in the occurrence and progression of cataract. Most of the dead LECs have obvious mitochondria empty bubble. So we speculate that the changes of mitochondria is the main reason of LECs death and cataract occurrence. Smac is recently identified as a mitochondria protein that promote apoptosis. In this project, we will konck down the Smac gen by RNAi delevered by lentivirus with GFP reporter, and study the effect of Smac on the proliferation,differentiation and death of LECs. We will detect the expression of Smac and apoptosis of LECs in the lens samples of cataract patients at different disease stagesin order to understand the regulatory effects of Smac in apoptosis of lens epithelial cells and the molecular pathological mechanism of cataract.

白内障是世界范围内占据致盲病因首位的眼病。既往认为晶状体上皮细胞凋亡可能是各种非先天性白内障形成的细胞学基础。我们在前期研究中发现，白内障发生、发展过程中晶状体上皮细胞存在凋亡、胀亡以及副凋亡三种死亡方式，且大部分死亡的晶状体上皮细胞中均存在明显的线粒体空泡化改变。因而我们推测，线粒体的改变是其晶状体上皮细胞死亡及白内障发生、发展的主要原因。Smac为近年来发现的与细胞凋亡有关的调节因子,是一种线粒体促凋亡蛋白。本课题我们将利用带有GFP报告基因的慢病毒介导RNAi敲除晶状体上皮细胞中的Smac基因，探讨Smac下调表达前后对晶状体上皮细胞增殖、分化及死亡方式的影响；结合临床白内障手术标本，免疫组化检测不同时期白内障患者晶状体标本中Smac的表达和晶状体上皮细胞的死亡率，解析Smac调控对晶状体上皮细胞死亡方式的影响，及其在白内障发病机制中的作用。

我们的既往研究认为，线粒体的改变是其晶状体上皮细胞死亡及白内障发生、发展的主要原因。Smac是一种与细胞凋亡有关的调节因子，也是一种线粒体促凋亡蛋白。本项目利用Smac基因siRNA慢病毒载体，成功构建能够稳定表达的人Smac低表达的HLE-B3株，研究Smac及线粒体途径凋亡对晶状体上皮细胞（lens epithelial cells，LECs）增殖、分化、凋亡的影响，进一步揭示其与白内障发生、发展的关系。通过不同浓度的H2O2构建氧化损伤模型，模拟不同程度的氧化损伤，论证了Smac诱导的线粒体凋亡途径与白内障的发生密不可分。进一步通过获取年龄相关性白内障患者及正常人LECs，发现年龄相关性白内障是由Smac与内质网应激（ERS）共同导致的，二者关系密不可分，且Smac可能通过调控内质网应激途径来调控细胞凋亡。再利用不同浓度的H2O2的HLE-B3氧化损伤模型，探讨不同程度的氧化损伤下，随着时间的推移，内质网应激的动态变化过程，探讨氧化应激与内质网应激之间的关系，发现细胞损伤后内质网应激的细胞保护作用可达到饱和程度，如损伤不解除则进一步转化成促凋亡的作用，进而导致白内障的发生，所以内质网应激在晶状体上皮细胞损伤后的修复或凋亡，起到了双向调控作用。之后，尝试在内质网应激过程中，加入内质网应激抑制剂Salubrinal，研究其在HLE-B3 发生ERS时是否具有保护作用，并具体研究了不同浓度Salubrinal的保护作用，找到了其保护作用的饱和阈值，为白内障的药物治疗提供了一定的参考价值。最后，设立siRNA Smac HLE-B3组、HLE-B3组、空白对照组，研究不同程度的氧化损伤后，随着时间变化，Smac的表达量与内质网应激的程度直接相关。且Smac与ERS的PERK-p-eIF2α通路直接相关，为白内障的预防和治疗提供了新的思路与作用靶点。