晶状体上皮细胞EMT的信号调节机制及其对后发性白内障的防治作用

晶状体上皮细胞发生间质转化(EMT)的过程是PCO发展的主线。TGF-beta是最强力的EMT诱导因子，整合素是细胞外基质诱导EMT的桥梁，而ILK是整合素和TGF-beta信号通路的交集点。本项课题拟构建ILK特异性小干扰RNA慢病毒重组体，检测ILK-RNA干扰前后晶状体上皮细胞增殖，迁移，收缩等功能的变化，以及其它相关信号分子(Smad、PI3K、ROCK) 的激活状况，从而证实ILK在晶状体上皮细胞EMT中的信号调控作用；并初步确定ILK和其它相关信号分子在细胞EMT中的关系。最后在大鼠PCO模型中证实慢病毒介导的ILK特异性siRNA能够长期下调ILK蛋白表达，达到防治PCO的效果。本项研究从细胞外刺激，细胞内信号转导，细胞功能变化，疾病发生等多个层次对应阐明PCO的发病机制，并为PCO的防治提供新的基因治疗方法和准确的药物靶点，故具有重要意义。

目的：.本项课题通过构建ILK特异性小干扰RNA慢病毒重组体（慢病毒－ILK siRNA）, 并将其应用于培养的晶状体上皮细胞，从而证实ILK在晶状体上皮细胞EMT中的调控作用，为进一步应用于临床提供理论依据。.方法：.1.取儿童白内障患者的晶状体前囊膜,分离、培养LEC。取第一代细胞进行实验。在细胞培养过程中，在培养基中加入不同浓度的TGF-β1和/或ECM, 作用24、48、72小时后检测细胞发生EMT的各项指标。.2.构建ILK基因RNA干扰慢病毒重组体，确定最佳转染浓度和感染复数，检测ILK基因沉默效果及ILK蛋白表达。.3.选择最佳浓度的TGF-β1和或ECM诱导体外培养的大鼠LEC发生EMT，并设置添加PBS，空慢病毒和慢病毒重组体。对以上各组细胞检测EMT各项指标。.4.应用western blot 检测以上各组中ILK和α-SMA蛋白表达状况以及细胞生物学行为的变化。.5.建立家兔PCO模型，确定适合的Kp392的浓度，在白内障手术完成时前房内注入ILK抑制物Kp392。40只成年家兔随机分为对照组、PBS组、空慢病毒组、Kp392组，以术后3d，7d，15d，30d，60d取后囊膜称湿重。并行眼组织的HE切片染色，免疫组化切片。.结果：.1.TGF-β刺激使原代培养的LEC增长速度减慢，使细胞内α-SMA阳性着染增强，并使原代人晶状体上皮细胞内出现了丝状的α-SMA阳性着染的stress fiber结构。且EMC可以协同这种作用。.2.筛选出的病毒重组体可以沉默ILK基因,减少ILK蛋白的表达。.3.通过测量EMT各项指标，TGF-β1可诱导体外培养的大鼠LEC发生EMT，而添加了慢病毒重组体可以阻止EMT的发生。.4.Western blot测得：在TGF-β1和ECM的作用下，添加PBS组和空慢病毒出现ILK蛋白和α-SMA表达均增强。但是加入了慢病毒-ILK RNAi的细胞组没有出现ILK和α-SMA的表达升高。.5.家兔后发障动物模型中，注入Kp392能够能够减缓兔后囊膜湿重的增加。眼组织HE切片中Kp392组与对照组未见明显差别。结论：.ILK 是LEC增殖和迁移的重要调控因子。慢病毒介导的RNAi沉默ILK基因可以阻止TGF-β1及ECM所诱导的人晶状体上皮细胞EMT过程。