α晶状体蛋白外消旋化对年龄相关性白内障发病的影响研究

年龄相关性白内障(ARC)是全球首位的致盲性眼病，至今发病机理不明。我们的前期研究表明晶状体蛋白的翻译后修饰(PTM)是晶状体衰老最重要的线索，而外消旋化则是含量最高的PTM。α晶状体蛋白作为人晶状体中最重要的结构蛋白，除了对晶状体蛋白有分子伴娘作用，我们的前期研究发现它还可以稳定晶状体的细胞膜，它的变性沉淀将显著影响ARC的发生和发展，这其中外消旋化的作用可能不容小觑。本课题将从细胞膜流动性和晶状体蛋白改变这两个角度入手，分析α晶状体蛋白外消旋化对ARC发病的影响。首先利用反相HPLC技术，分析自然和模拟衰老条件下，α晶状体蛋白外消旋化的位点和程度，再观察它对晶状体细胞膜的稳定效应和其分子伴娘功能；为了排除其他PTM的干扰，进一步用L-异天冬氨酰甲基转移酶(PIMT)特异性地逆转游离及组织内α晶状体蛋白Asx残基的外消旋化，然后观察其效应。通过本研究希望能为ARC的防治提供更好的切入点。

晶状体蛋白发生的翻译后修饰（Post-translational modification，PTM）是晶状体衰老的重要线索，而外消旋化（racemization）是老年晶状体中含量最高的PTM。α晶状体蛋白作为晶状体中含量最高的结构蛋白，也是最重要的小热休克蛋白，其发生外消旋化可能对年龄相关性白内障的发生发展产生重要影响。本课题旨在分析自然衰老和加热模拟衰老条件下，α晶状体蛋白外消旋化后的效应，包括其自身外消旋化程度，对晶状体细胞膜流动性的调节效应和对其他晶状体蛋白分子伴娘功能的影响，以探究α晶状体蛋白外消旋化在年龄相关性白内障发病中的作用。在第一部分研究中，我们优化了反相高效液相色谱的实验洗脱方案，检测人晶状体组织及晶状体上皮细胞加热模型中α晶状体蛋白的外消旋化程度。在第二部分研究中，我们则用年龄相关性白内障患者晶状体组织和晶状体上皮细胞加热模型来分别探究自然衰老和模拟衰老两种条件下，α晶状体蛋白外消旋化增加，对晶状体细胞膜流动性和其他晶状体蛋白分子伴侣功能的相关效应，其中Laurdan染色+双光子共聚焦显微镜这一方法我们又再次创新用于分析晶状体细胞膜流动性。在第三部分研究中，我们通过小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）特异性抑制晶状体上皮细胞中的异门冬氨酸甲基转移酶（Protein-L-isoaspartate (D-aspartate) O-methyltransferase， PIMT）后，观察α晶状体蛋白的外消旋化程度改变，并观察其对晶状体细胞膜流动性的调节效应和对其他晶状体蛋白分子伴娘功能的改变。本研究发现，在自然衰老和模拟衰老条件下，α晶状体蛋白外消旋化程度增加，伴随着晶状体细胞膜流动性的增加和对其他晶状体蛋白分子伴侣功能的减弱。而在特异性抑制PIMT酶后，我们发现晶状体上皮细胞中α晶状体蛋白外消旋化程度增加，伴随着晶状体细胞膜流动性的增加和对其他晶状体蛋白分子伴侣功能的减弱。本研究表明，随着年龄增长，α晶状体蛋白的外消旋化程度明显增加，导致对晶状体细胞膜流动性的调节减少，对其他晶状体蛋白的分子伴侣功能亦下降，从而大大加速了晶状体的整体衰老，促进了年龄相关性白内障的发生。