双靶点干预对糖尿病视网膜病变中“血管-纤维化开关”的调控

In the treatment of Proliferative diabetic retinopathy (PDR), it is concerned how to inhibite neovascularization and reduce the formation of fibrous membranes meanwhile. The conversion mechanism between angiogenesis and fibrosis proliferation is called "vascular - fibrosis switch." Our previous work demonstrated that changing the ratio of pro-fibrotic factor (CTGF) and pro-angiogenic factor (VEGF) (CTGF / VEGF) can contral the "vascular - fibrosis switch". On this basis, this paper choose the most effective antagonists of VEGF named lucentis in clinic and antagonists of CTGF named CTGF shRNA to interven double targets; through animal experiments, detect retinal electrophysiology, vascular structures, blood - retinal barrier, and expression levels of CTGF and VEGF; through cell experiments, detect expression levels of CTGF and VEGF in retinal vascular endothelial cells and choroidal fibroblasts, cell proliferation and contraction force; and discuss the adjustment mechanism about Wnt / β-catenin signaling pathway. We expect the intervention strategies can provide a new way to block the progress of the neovascularization and proliferation of PDR.

增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）的治疗中，如何在抑制新生血管的同时减少纤维血管膜的形成，备受关注。血管新生和纤维化增殖之间存在转换机制，称为"血管-纤维化开关"。我们前期工作中证实可以通过促纤维化因子（CTGF）与促血管生成的因子（VEGF）的比值（CTGF/VEGF）将"血管-纤维化开关"数值化。在此基础上，本课题拟选用临床最为有效的VEGF拮抗剂lucentis和CTGF拮抗剂CTGF shRNA进行双靶点干预；通过动物实验，检测视网膜电生理、血管结构、血-视网膜屏障等及CTGF、VEGF表达水平的改变；通过细胞实验，检测视网膜血管内皮细胞和脉络膜成纤维细胞中CTGF、VEGF表达变化、细胞增殖及收缩力的改变；并对涉及的Wnt/β-catenin信号通路中相互调节机制进一步探讨。我们期望该干预策略为阻断PDR的新生血管和纤维增殖病变的进展，提供一个新的思路。

在增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）中，如何在抑制新生血管的同时减少纤维血管膜的形成备受关注。本课题重点研究抗VEGF治疗所致纤维化的分子机制，致力于寻找针对纤维血管膜形成的治疗靶点。首先我们应用RNA-Seq技术对抗VEGF处理后的视网膜血管内皮细胞进行全转录组测序，分析发现，两者之间差异基因的功能涉及分子生物学过程调控及细胞能量代谢、蛋白合成等方面。其中SI与蛋白合成相关，BIRCT、GP1BA与细胞增生凋亡相关，ABLIM1、CRB2与视网膜发育相关。差异基因的功能主要划分为生物学行为调控、细胞成分及分子功能三大板块；Notch信号通路、ECM受体通路、MAPK信号通路、TGF-β信号通路、Wnt信号通路表达在两组细胞间存在差异。后期我们制备了CTGF shRNA 慢病毒颗粒来感染视网膜血管内皮细胞。发现以MOI 20、时间点72h的CTGF病毒转染率效果最佳，CTGF shRNA慢病毒感染可显著下调ECM相关蛋白FN、α-SAM、ColⅠ的表达。这为抗VEGF药物联合抗CTGF双靶点治疗PDR中CTGF慢病毒最佳剂量的探索提供分子生物学依据。我们紧接着双靶点干预视网膜血管内皮细胞，并应用RNA-seq和iTRAQ技术检测细胞、PDR患者玻璃体组织和血清，发现抗VEGF治疗会上调FSTL1的表达，而在细胞水平上的双靶点干预则会显著下调FSTL1的表达。这表明FSTL1和CTGF存在某种关联，FSTL1是抗纤维化治疗的一个非常重要的关键因子。我们从多方面探索抗VEGF药物与纤维化加剧间的关系，发现抗VEGF药物对视网膜纤维化的影响是多层次、多方面、多靶点的复杂过程，其通过调节多个作用途径及相关基因的表达影响视网膜纤维化。我们的研究为通过靶向基因治疗，缓解抗VEGF引起的纤维化，为临床治疗提供新思路，为临床一线早日开发出更为优化的PDR治疗药物提供了生物学依据。