基于Sp1调控VEGFR2基因转录及蛋白泛素化水平的益母草促血管生成药效物质与作用机制研究

The aerial parts of Leonurus japonicus Houtt. are called “motherwort” or “Yi Mu Cao” (Chinese) and have significant therapeutic effects on gynecological diseases and cardiovascular and cerebrovascular diseases, such as postpartum subinvolution of uterus, irregular menstruation, myocardial infarction, and stroke. Note that treatment of these diseases is closely related to angiogenesis. Thus, the applicant explored the promoting effect on angiogenesis of motherwort. The experiments not only found that the n-BuOH extract was the active fraction and the total alkaloids from the n-BuOH extract were the active ingredients, but also forecasted the molecular mechanism by bioinformatic big data analytical system. Then further study confirmed the effect of the active portion on Sp1 and VEGFR2. Based on the above experiment foundation, this project proposes a hypothesis that VEGFR2 may be affected by Sp1 through two pathways, regulation of the gene transcription of VEGFR2 and regulation of the protein ubiquitination of VEGFR2. Thus, this project intends to perform further researches. By using chromatographic and spectroscopic techniques, alkaloids will be isolated quickly from the active fraction of motherwort, and the main constitutes of the active fraction will be illuminated. Subsequently, the promoting effect on angiogenesis of isolated alkaloids will be evaluated by HUVECs and zebrafish models. Then, molecular biological techniques will be used to study the effect on Sp1, A20, and VEGFR2 expressions of the active compounds. Finally, the project will investigate the initiation effect on VEGFR2 and A20 genes of Sp1, and whether A20 is related to de-ubiquitination of VEGFR2 protein. Through the above study, this project is expected to illuminate the material basis and molecular mechanism of motherwort for promoting effect on angiogenesis, which can provide evidences for the clinical application of motherwort.

益母草对妇科和心脑血管疾病具有显著疗效，如产后复旧不良、月经不调、心肌梗死、中风，而这些疾病的治疗均与促进血管生成相关。因此，申请人前期探索了益母草促血管生成作用，不仅发现正丁醇提取部位为活性部位，总生物碱为活性组分，而且采用生物信息学大数据分析系统对分子机制进行预测，并实验确证了活性组分对Sp1和VEGFR2的影响。基于以上基础，本项目提出：Sp1可能通过两条途径影响VEGFR2，调控基因表达和调控蛋白泛素化水平。因此，拟开展深入研究：应用色谱和波谱技术研究生物碱成分，阐明活性组分的组成；采用HUVECs细胞和斑马鱼模型研究促血管生成作用；应用分子生物学技术检测活性成分对Sp1、A20、VEGFR2蛋白和基因表达的影响；研究Sp1对VEGFR2和A20基因的启动作用，并明确A20是否与VEGFR2去泛素化相关。通过上述研究，以期阐明益母草促血管生成的物质基础和机制，为其临床用途提供依据。

益母草对妇科和心脑血管疾病具有显著疗效，如产后复旧不良、月经不调、心肌梗死、中风等，而这些疾病的治疗均与血管生成相关。本项目基于益母草的临床用途和祛瘀生新功效，首次提出并验证了益母草生物碱具有良好的促血管生成作用。项目顺利完成了预期研究内容和研究目标，主要进展包括：（1）益母草生物碱类研究取得新突破：采用UPLC-Tof-HRMS联用技术和现代色谱波谱方法，分离鉴定了65个生物碱及氨基酸类成分，含新化合物13个，基本揭示了益母草生物碱类的主要组成。创新性发现生物碱类成分是不同产地益母草的主要差异性成分，鉴别了水苏碱、益母草碱、4,5-二羟基-3-甲氧基益母草碱、丁香酰胆碱等7个具有产地差异的特征性生物碱，提示这与不同产地益母草的促血管生成活性差异有关。（2）明确了益母草生物碱的促血管生成作用，获得活性成分：通过HUVECs细胞、转基因斑马鱼、鸡胚胎绒毛尿囊膜模型，发现益母草碱、水苏碱、西贝碱、左旋水苏碱、益母草环肽B等一系列生物碱具有明显的促血管生成活性。（3）阐释了益母草生物碱促血管生成作用的分子机制，验证了本项目的科学假说：采用Western Blot、Real-time PCR、染色质共沉淀、免疫共沉淀、shRNA基因沉默等技术，明确了益母草生物碱可通过Sp1-A20-VEGFR2信号通路发挥促血管生成作用，即益母草碱既可以通过Sp1直接调控VEGFR2基因的表达，又可以通过Sp1-A20影响VEGFR2蛋白的泛素化。此外，益母草总碱、水苏碱可通过VEGFR2/MEK/ERK信号通路和线粒体介导的凋亡信号通路发挥促血管生成作用。本项目不仅在一定程度上阐明了益母草促血管生成的物质基础和作用机制，而且很好地完善了我们对益母草传统功效的现代认识，为益母草的临床使用提供了更多科学依据。本项目发表学术论文14篇，其中SCI论文6篇、核心期刊论文5篇；获授权发明专利1项；获中医药国际贡献奖-科技进步二等奖；项目负责人作学术报告6次，获国家自然科学基金“优秀青年基金”、入选国家中医药管理局“青年岐黄学者”、四川省学术技术带头人等；项目组6人晋升副高级职称，1人晋升中级职称，培养研究生5名。