利用斑马鱼血管可视化研究生长期鹿茸蛋白促血管生成的作用及机制

Angiogenesis at the early stage of Ischemic Cardiovascular and cerebrovascular disease helps alleviate tissue injury and reduce occurrence rate of myocardial or cerebral infarction. Our previous research has proved that velvet antler can improve cardiac functions not only for patients with heart failure but rats after myocardial infarction. Further results have found that velvet antler proteins could protect cardiac microvascular endothelial cells from ischemia-hypoxia, and influencing angioblast activity by regulating PI3K/AKT-mTOR and Notch signaling pathway. This research aims to utilize the transparent embryo zebrafish to make angiogenesis visible so as to visually evaluate velvet antler proteins’ effects on angiogenesis applying techniques like Angiogenesis as well as Deletion-Degeneration. We try to explore velvet proteins’ effects on angiogenesis and its possible mechanisms from a histology, biochemistry and molecular biology level at zebrafish different growth stage, to provide a novel idea and scientific basis for treating ischemic diseases with TCM and interfering with repairing of damaged tissues to lessen injuries at the early stage.

缺血性心脑血管疾病早期血管生成能够减轻组织损伤，减少心梗、脑梗的发生几率。课题组前期研究证实，鹿茸能够改善心衰患者及心梗后大鼠的心功能，进一步研究发现鹿茸蛋白能够通过调控PI3K/AKT-mTOR及Notch信号通路保护缺血缺氧受损的心脏微血管内皮细胞、影响成血管细胞的活力；本研究利用斑马鱼胚胎时期身体透明特征，使血管新生可视化，应用“缺失-再生”技术，在斑马鱼“胚胎-幼鱼”阶段及“幼鱼-成鱼”阶段直观、动态地评价鹿茸蛋白对血管新生的干预作用；在斑马鱼不同生长阶段，从组织学、生物化学、分子生物学水平探讨鹿茸蛋白调控血管生成的作用和可能机制，为研究中药治疗缺血性心脑血管疾病，早期干预缺血组织的修复、减少损伤提供新的科学依据和研究思路。

项目采用心脏注射方法给药鹿茸蛋白，选出鹿茸蛋白干预的较优浓度为50ng，观察鹿茸蛋白干预后血管缺陷模型鱼体内SIVs和ISVs血管生成情况、血流速度、血流量；另制备斑马鱼断尾模型，观察鹿茸蛋白干预后断尾处组织、血管生成情况及幼鱼游动轨迹等。应用Rt-PCR及基因测序建库等技术挖掘鹿茸蛋白影响血管内皮细胞功能进而促进血管生成的可能分子机制。研究发现，鹿茸蛋白对斑马鱼“胚胎至幼鱼”阶段血管生成具有促进作用，且不会导致血管异常生长。随着鹿茸蛋白剂量增加，血管生长越好，注射50ng鹿茸蛋白时达到最大。鹿茸蛋白对斑马鱼“幼鱼至成鱼”时期的断尾具有一定促进作用，但对斑马鱼移动距离、速度和相对移动时间没有显著影响，顺逆时针旋转频率在10ng鹿茸蛋白时达到最大，但是变化并不显著。断尾处血流相对速率在100ng鹿茸蛋白时达到最大。鹿茸蛋白对斑马鱼心率有促进作用，注射50ng鹿茸蛋白时达到最大，当药物剂量大于50ng后，随着注射剂量增加，心率促进作用减弱。但均没有统计学差异。在RT-PCR结果中我们发现，VEGF相关信号网络在鹿茸蛋白促血管生成作用中并没有出现明显作用。为了寻找药物作用可能引起的差异基因，我们做了RNA基因测序。在基因检测结果中，72hpf-0组与72hpf-50组的表型结果最优，故作为基因检测对比的主要组别。两组差异基因表达数量较多，其中以代谢类信号途径相关信息占比多，NOD样受体信号通路和Jak-STAT信号通路较为惹人注意。