禽源肠炎沙门氏菌PmrA-PmrB突变对粘杆菌素耐药性的调控机制研究

S. enteritidis isolated from poultry is an important zoonotic agent, and also a foodborne pathogenic bacterium. Colistin-resistant S. enteritidis poses a big threat to the treatment of super bacteria (multidrug-resistant gram-negative pathogens) infection. Studies showed that two-component regulatory system PmrA-PmrB was important for the resistance to polymyxin. However, regulation mechnism of colistin resistance by PmrA-PmrB in S.enteritidis is still unclear.According to the colistin resistance status in veterinary clinics, the major mutations of PmrA-PmrB will be analyzed for colistin-resistant S. enteritidis from poultry in this program. After gene splicing by overlap extension PCR and homologous recombination, mutational strains of S. enteritidis will be received. And then, FQ-RT-PCR will be used to assay in vitro expression of relevant genes. Thus, it will be basically clear for regulation mechanism of colistin resistance by PmrA-PmrB mutations in S. enteritidis. Moreover, the relationship between PmrA-PmrB mutations and the use of low-concentration colistin, and the effects of PmrA-PmrB mutation on antimicrobial susceptibility and bacterial fitness, will be evaluated. If this program can be performed, it will provide a scientific reference for guiding the use of colistin in food-producing animals, predicting spread and dissemination of colistin-resistant S. enteritidis in the environment, and public health security.

禽源肠炎沙门氏菌是重要的人畜共患病原菌，可通过食源性途径感染人，对粘杆菌素耐药的肠炎沙门氏菌给超级细菌（多重耐药革兰氏阴性菌）感染的治疗带来了极大威胁。研究表明，二元调控系统PmrA-PmrB对于多粘菌素耐药性的产生具有重要作用，有关肠炎沙门氏菌PmrA-PmrB对粘杆菌素耐药性的调控机制尚不清楚。本项目紧密结合兽医临床实际，拟分析对粘杆菌素耐药的禽源肠炎沙门氏菌PmrA-PmrB的主要突变，采用重叠延伸PCR和同源重组方法构建突变菌株，然后用实时荧光定量PCR方法分析PmrA-PmrB突变对于关联基因的表达调控，初步了解肠炎沙门氏菌PmrA-PmrB突变对粘杆菌素耐药性的调控机制；同时，评估粘杆菌素选择压力与PmrA-PmrB突变的关系以及PmrA-PmrB突变对菌株耐药性和适应性的影响。本项目的实施可为指导食品动物粘杆菌素用药、预测耐药菌株在环境中的散布以及公共卫生安全提供科学参考。

禽源肠炎沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌，也是最重要的食源性病原菌之一。粘杆菌素在兽医临床上广泛用作饲料添加药物，作为临床治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的“最后一线希望”，沙门氏菌对粘杆菌素的耐药性成为全球关注的焦点问题之一。我们在系统调查沙门氏菌的流行性和耐药性的基础上，发现禽源肠炎沙门氏菌对粘杆菌素的耐药性逐年升高，但其耐药机制尚不明晰。因此，本项目以与粘杆菌素耐药性密切相关的二元调控系统PmrA-PmrB为切入点，分析了禽源肠炎沙门氏菌PmrA-PmrB的基因突变以及与粘杆菌素耐药性的关系；构建基因突变株，研究了基因突变前后菌株的耐药性和体内外适应性等。.1. 通过对临床分离和诱导耐药沙门氏菌PmrA-PmrB的分析，确定粘杆菌素耐药沙门氏菌PmrA-PmrB基因的主要突变为：（1）PmrB基因445位碱基由G变为A，对应149位氨基酸由D变为N；（2）PmrB基因333-341缺失9bp，导致112-114位氨基酸缺失。.2. 运用同源重组技术，分别构建了重组质粒puc57-197-cat-sacB、puc57-249-cat-sacB和pKD46-rha-IS；然后，经过两次重组，成功获得了4个阳性突变株。.3. 用qRT-PCR方法分析了所有菌株PmrA、PmrB和关联基因（PmrC、PmrE和PmrHIJKLM）的表达情况，结果表明本研究确定的两种基因突变明显促进了这5种基因的表达（P<0.005）。.4. 耐药性研究结果表明，突变后沙门氏菌对粘杆菌素的MIC值明显增加，而对其余药物的MIC值没有明显变化；体内外适应性的研究结果表明，与突变前菌株相比，突变后沙门氏菌的适应性有所降低，因此预测其在环境中的扩散能力相对稍低，但是仍具有扩散风险。. 总之，本研究首先发现并鉴定出了禽源肠炎沙门氏菌PmrA-PmrB 上两种与粘杆菌素耐药性相关的基因突变；其次，通过构建基因突变菌株，研究突变前后菌株的耐药性和对关联基因的表达调控，确证了这两种基因突变对于肠炎沙门氏菌耐受粘杆菌素的作用以及初步作用机制；最后，对突变前后菌株进行体内外适应性的分析，评估了基因突变菌株在环境中的扩散能力。本研究结果为深入研究肠炎沙门氏菌对粘杆菌素耐药机制、兽医临床粘杆菌素的用药以及公共卫生安全提供了参考。