食源肠炎沙门氏菌亚致死规律及其热损伤复活机制研究

沙门氏菌，特别是肠炎沙门氏菌极易污染肉类、鱼类、禽肉类、奶类、蛋类食品。如何最大可能的避免亚致死沙门氏菌出现并提高其检出水平是迫切需要解决的问题。有赖于深刻理解沙门氏菌亚致死规律和揭示沙门氏菌受伤复活机制。热激应答σ32因子对沙门氏菌的热致死和亚致死细胞的复活具有密切关联。本课题拟利用基因同源重组原理，用突变的外源片段整合入受体细胞的rpoH同源序列中，取代rpoH基因从而获得基因型发生突变的基因打靶肠炎沙门氏菌。实现此菌的rpoH定点突变株。再用肠炎沙门氏菌突变株与野生株进行热击试验研究，考察两种菌株的热致死特征和亚致死状态的复活，以及使用培养基的筛选，确定最适培养基和及其添加物，培养条件。开展本课题研究，为食品保鲜加工提供理论指导，同时为改进现有沙门氏菌的检测方法提供理论指导，此外，研究结果将会对其它病原微生物的检测和了解其它微生物的同源基因功能提供借鉴。

构建肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis IFO3313 株的rpoH 基因缺陷株IFO3313- ΔrpoH，比较不同温度下缺陷株与野生株的热激响应特性。利用λ-Red 重组系统对Salmonella enteritidis IFO3313 的rpoH 基因进行缺失突变，并使用PCR 方法对其进行验证，在此基础上使用不同培养基对缺陷株与野生株进行不同温度下的热激应答结果和亚致死热损伤修复能力的考察：野生株比缺陷株有更强的热激耐受能力，在DHL 平板上对亚致死热损伤的肠炎沙门氏菌的分离检测可能具有假阴性，野生株比缺陷株在TSYA平板上有更强的修复能力。. 利用λ-red同源重组系统构建食源性肠炎沙门氏菌（salmonella enteritidis ,S.E. CICC21482）rpoS基因缺陷株S.E./⊿rpoS，考察其在胁迫环境中的生长特性，以探讨rpoS基因的生物学作用。通过PCR扩增出两侧为肠炎沙门氏菌rpoS基因同源臂，中间为卡那霉素抗性基因(kmr)的打靶片段，再电击转入含质粒pkD46的S.E.中，替换rpoS基因，筛选阳性转化子S.E./⊿rpoS并用PCR法验证。成功构建了肠炎沙门氏菌rpoS基因缺陷株，通过比较缺陷株和野生株，在正常LB培养基中37℃培养时发现两者的生长曲线没有显著的差别（P>0.05），S.E./⊿rpoS菌株在45℃、2%NaCl和pH 4.0应激条件下的生存能力明显比野生株弱（P<0.05）。说明rpoS基因在肠炎沙门氏菌克服高温、高渗、酸应激时被诱导表达从而发挥重要的作用。. 利用λ-red重组系统构建肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis, S.E)的rpoE基因缺陷株ΔrpoE，并考察ΔrpoE的生长特性。构建两侧为rpoE基因同源序列，中间为卡那霉素抗性基因(kan)的重组片段pKD4-kan，电击转入S.E中，在质粒pKD46介导的Red重组系统的作用下，pKD4-kan与rpoE基因发生同源重组，置换掉rpoE基因，获得基因缺陷株ΔrpoE。然后比较野生株和缺陷株在不同温度条件下的生长情况。在37℃条件下，二者生长情况几乎无差别(P>0.05)；在30℃的低温和42℃的热激条件下，缺陷株的生长能力明显弱于野生株(P<0.05)。