结核分枝杆菌Rv3117和Rv3120介导机体CD8+T细胞免疫的分子机制及相关CTL表位肽活性研究

Tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium tuberculosis, is still a serious global public health problem. Accruing data strongly support the possible role of CD8+ T cells in immunity against TB. Our previous study found that Mycobacterium tuberculosis RD5-encoded antigens, Rv3117 and Rv3120, were two immunodominant antigens and could induce specific CD8+ T cell proliferation, however, the specific mechanism and the relevant function is unclear. Therefore, in the present project, we will use Rv3117 and Rv3120 as target antigens, and design the HLA-A2 restricted (covering most people) CTL epitopes with the help of computer molecular mimicry, from the level of molecules, cells and animals, to elucidate the molecular mechanism of the CD8+ T cell immune responses induced them and the related activities of CTL epitopes by integrating various methods, including T2 binding affinity and stability, Tetramer/peptide assay, CFSE T cell proliferation, IFN-γ ELISPOT, FCM staining, CD107a/b and LDH cytotoxic activity and in vivo killing assay of HLA-transgenic mice. The results would not only provide novel targets of TB polypeptide vaccines in the new viewpoint of RD5-encoded antigens, but also provide new ideas for TB prevention and control.

结核病由结核分枝杆菌引起，迄今仍是一个危害严重的全球性公共卫生问题。CD8+T细胞在机体抗结核感染免疫中发挥重要作用。我们前期研究发现，结核分枝杆菌RD5区编码蛋白Rv3117和Rv3120是2个新的免疫优势抗原，可诱导机体特异性CD8+T细胞的增殖，但具体机制及相关功能尚不明确。为此，我们拟以上述蛋白为靶抗原，采用计算机分子模拟技术，设计HLA-A2限制性（覆盖多数人群）CTL表位肽，从分子、细胞和动物水平上，通过CTL表位肽与HLA的结合力和稳定性、Tetramer/肽复合物染色、CFSE细胞增殖、IFN-γ ELISPOT、FCM胞内外多因子染色、CD107a/b和LDH细胞毒及HLA转基因小鼠体内杀伤活性等实验来阐明其介导机体CD8+T细胞免疫反应的分子机制及相关CTL表位肽活性。本研究将从RD5区抗原这个新视点为构建新型结核多肽疫苗提供候选靶点，为结核病免疫防治提供新的思路。

结核病由结核分枝杆菌引起。课题组以前期发现的结核分枝杆菌RD5区免疫优势抗原Rv3117和Rv3120及抗原特异性CD8+T细胞为研究对象，首次通过生物信息学预测并报道了这2个抗原来源的HLA-A3和HLA-B7限制性CTL表位在世界范围内其人群理论累计覆盖率高达87.2%，从而为联合CD4+T表位和CD8+T表位的新型结核疫苗的设计奠定了理论依据。通过分子、细胞、免疫等相关技术初步明确结核分枝杆菌 Rv3120 来源的P93-1Y肽段具有HLA-I限制性，可诱导CD8+T细胞的增殖与活化，是结核多肽疫苗的候选CTL表位，为进一步的动物攻毒保护验证实验提供了前提。此外，课题组利用本项目建立起来的研究平台，利用24位点可变串联重复序列和间隔区寡核苷酸分型技术，对河南省668株结核分枝杆菌进行了基因型鉴定，明确河南省结核分枝杆菌主要为北京家族基因型，为制定河南地区结核病的防控策略提供了依据。利用凝集素免疫测定技术发现毒力最强的分枝杆菌的LAM末端具有更多的甘露糖残基，利用ELISA和流式细胞术等方法，发现了不同的LAM对宿主细胞DCs具有不同的活化和免疫调节作用，毒力最强的分枝杆菌M.tuberculosis H37Rv高于毒力较弱的M. sp. QGD101，其次为M. smegmatis mc2 155，从而为分枝杆菌菌种鉴定、以糖抗原为靶点的结核疫苗免疫策略提供了部分新的实验证据。