根瘤内生菌对PAHs污染土壤生物修复过程中的响应机制

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are highly hydrophobic and persistent hazardous organic compounds which can be detected in soils worldwide..Due to nitrogen fixing properties of legume, it enhances the accumulation of nitrogen and organic matter in bioremediation PAHs contaminated soils. There is not only rhizobium living in the root nodule, but also PAHs degrading bacteria. This interesting phenomenon has not been explored very well. We intend to establish the legume and rhizobium symbiosis. Apply the legume and root nodule endophytes for phytoremediation by using the latest molecular biology technology (eGFP, SSH, Real-time PCR) and metagenomics methodologies (high-throughput sequencing) may be a new direction other than the rhizosphere research. The PAHs dissipation mechanisms were investigated to determine if the root nodule endophytes plays a role in PAHs removal. The mechanism of PAHs bioremediation by root nodule endophytes would be helpful to control soil PAHs contamination.

多环芳烃（PAHs）是环境中广泛存在的一类难降解有机污染物。利用豆科植物—根瘤菌共生固氮体系修复氮素缺乏的有机污染土壤优势明显。然而根瘤组织中除根瘤菌外，还定殖着许多未知非共生细菌，这些内生菌在响应PAHs污染和生物修复过程中的作用机制尚不清楚。本项目通过构建优势豆科植物—根瘤菌共生体系，分离鉴定根瘤内生PAHs降解菌，确定其促生降解特性。然后通过绿色荧光蛋白eGFP标记示踪其侵染定殖过程。进一步利用高通量测序横向对比四种微域（根系表面、根系内部、根瘤表面、根瘤内部）降解菌种群差异，进而从多样性水平阐明其响应机制。最后使用抑制差减杂交SSH分析根瘤内生菌在PAHs污染胁迫下基因差异表达，并利用Real-time PCR对降解基因进行定量分析，进而从基因水平揭示其响应机制。本研究将在土壤根际微生物修复基础上探索一个根瘤内生菌修复的新方向，从而为制定高效绿色的有机污染修复技术提供新的理论依据。

本项目选用多环芳烃菲作为污染源，探究多环芳烃对土壤微生物菌群的影响机理。通过构建优势豆科植物—根瘤菌共生体系，分析豆科植物根系环境对微生物降解多环芳烃菲的影响。进一步分离豆科植物根部四种特殊微域PAHs降解菌，确定其促生降解特性。并通过绿色荧光蛋白标记(eGFP)示踪其侵染过程。最后通过高通量测序横向对比四种特殊微域（根系表面、根系内部、根瘤表面、根瘤内部）降解菌种群差异，进而从多样性水平阐明其响应机制。最后分析根瘤微域菌群在PAHs污染胁迫下基因差异表达，对降解菌丰度和双加氧酶基因进行分析，从而从基因水平揭示其响应机制。通过研究发现：.（1）从根瘤内生菌中分离到7株PHE降解菌，其中C9和D17菌株成功扩增到双加氧酶降解基因片段。7株根瘤内生细菌均有分泌IAA的能力，其中D17分泌能力最强。5株菌株能够产生溶磷圈。F15产生生物表面活性剂可将水的表面张力降至32.5mN/m。在72小时内，D17、A3、C9对PHE的降解率分别为94.4%，85.5%，81.4%。通过eGFP成功标记了根瘤内生菌，示踪了其侵染定殖途径。.（2）不同多环芳烃在土壤中降解速率降解效率存在差异。在多环芳烃加入前期，Sphingomonadacea、Burkholderiaceae是土壤体系中主要的微生物。菲、芘降解过程中Xanthobacteriaceae逐渐成为主要微生物。其中Sphingomonadacea、Burkholderiaceae与TOC呈正相关，Xanthobacteriaceae与TOC呈负相关。.（3）豆科植物会使土壤降解菲的速率有所提升且菲对土壤的微生物的多样性和丰富度水平影响减小。培养初期土壤体系Clostridiaceae、Burkholderiaceae、Azospirillaceae微生物含量较高。随菲降解过程的进行，豇豆-土壤体系中的Magnetospirillaceae、Sphingomonadacea成为比例最高的微生物。Azospirillaceae随培养阶段进行比例逐渐上升，说明豇豆固氮作用加强。.（4）在含菲的土壤环境中微生物仍以蛋白质的合成和能量的转换生产为主要代谢活动以保证自身生长发育。在菲降解过程中根瘤表面信号转导活动逐步增强，根瘤内部减少了信号转导活动进行了更多的脂质转运和代谢。.