大豆根瘤内生菌对小麦的促生作用机理研究

Root nodule endophytic diazotrophs play an important role in nitrogen fixation, promoting growth, etc. for legumes, while its research is relatively weak in wheat of cereal crop, and how to exert its promoting growth for wheat becomes a bottleneck of efficient use root nodule endophytes. Soybean (Glycine max L.) root nodule endophytes and wheat(Triticum aestivum L.) zhoumai18 as research objects, and the phylogenetic status of screened excellent strains was established based on 16S rRNA and recA genes sequence analysis. Excellent strains marked by GFP were positioned and studied about its survival law in plants by confocal laser technology. The effect of inoculation bacteria on growth traits of wheat was detected, and enzymatic activities of chitinase, peroxidase, polyphenol oxidase, etc, in wheat seedling were determined to validate whether induced systemic resistance of wheat. Populations of dominant endophytes inside wheat root after inoculation were analyzed by PCR-DGGE technology. Based on interaction between labeled strains and wheat plants, growth promoting mechanism of strains to wheat was revealed. This project will provides certain theory base for the development of legume root nodule endophyte resources for using in wheat crops, wide the new fields to investigating the growth-promoting resources of cereal crops.

根瘤内生固氮菌在豆科植物固氮、促生长等方面发挥着重要作用，而在禾本科作物小麦上的研究较为薄弱，如何发挥对小麦的促生作用是高效利用根瘤内生菌的瓶颈。本项目以大豆根瘤内生菌和小麦（周麦18）为研究对象，筛选优良性状的内生菌资源，测定其16S rRNA、recA基因序列以确立系统分类地位；借助激光共聚焦技术研究GFP标记优良菌株在小麦植株内的定位和存活规律；检测接菌对小麦生长性状指标的影响；测定小麦体内几丁质酶、过氧化物酶、多酚氧化酶等酶活性来验证能否诱导小麦产生系统抗性；采用PCR-DGGE技术分析接菌后植株根部优势内生菌的种群类型。基于标记内生菌和小麦植株间的关系，揭示接种菌株对小麦的促生作用机理。本项目为开发豆科植物根瘤内生菌资源在小麦上的应用奠定理论基础，也为探讨禾本科作物的促生资源拓宽新的研究领域。

豆科植物根瘤内蕴藏着丰富的微生物资源，尤其是在根瘤特殊微环境内与根瘤菌协同共存促进宿主生长的内生菌，发挥着重要功能，但未引起科学研究者的重视。大豆和小麦是河南大宗作物，从河南13个市（地区）36个点采集的大豆根瘤中分离纯化出276株内生菌，筛出8株具ACC脱氨酶活性菌株，其中DD132酶活性最高（15.712 U/mg），且对小麦幼苗生长具有明显促生长作用；兼有较强耐盐碱能力，存在抗逆促生潜能。筛选出36株具有溶磷特性菌株，其中20株有较强溶磷性，其中DD291发酵液中可溶性磷含量最高（452 mg/L），发酵液pH与对照相比均有不同程度下降，最大降幅达2.92。而且大部分溶磷性内生菌具有较强耐盐碱性，对Pb2+、Cr6+和Cu2+有较高耐受性，对Ni2+和Hg2+抗性较弱。结合细胞形态、生理生化、16S rDNA、recA序列和系统发育分析结果，溶磷菌株初步鉴定为Bacillus cereus, Enterobacter cancerogenus, E. cloacae和Pseudomonas putida。产吲哚乙酸（IAA）试验表明，90%以上内生菌株能产生IAA。采用对峙法、代谢液培养法从内生细菌中筛选出对大豆轮纹病菌（Ascochyta glycines Miura）、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、烟草赤星病菌（Alternaria longipes）等病原菌具有拮抗性菌株，并16S rDNA测序初步确定其系统发育地位。采用蛋白质图谱检测以及GFP 荧光标记对优良菌株在小麦植株内的定殖研究，同时对接种后不同时期小麦根部进行取样，确定标记菌株在群落中的地位，结果表明接种菌株在小麦幼苗的根茎叶内都有存在。小麦接菌后的不同时期测定植物的防御相关酶：过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、多糖、叶绿素含量等，结果表明接种内生菌与小麦苗期防御酶间存在一定相关性，可诱导小麦植株产生系统抗性，筛选菌株对小麦幼苗有促生作用。