二氧化硅诱导的NLRP3炎症小体活化对远端气道上皮干细胞再生的影响

Inhalable silica particle, the etiology of silicosis, is one of the well-recognized activator of NLRP3 inflammasome. Till now, it is believed that lung epithelial regeneration plays a vital role in the functional recovery of respiratory disease. However, whether silica-induced activation of NLRP3 inflammasome is involved in the regulation of lung regeneration is still unclear. In this project, we firstly investigate the temporal and spatial changes of distal airway epithelial regeneration in mouse model of silicosis. Next, by using the inhibitor of NLRP3 inflammasome (MCC950) as well as NLRP3 gene knockout and Caspase-1 gene knockout mice, we investigate the effects of silica-induced activation of NLRP3 inflammasome in regulating distal airway epithelial regeneration and the microenvironments (niche) of lung epithelial stem cells. Further, bronchioalveolar stem cells will be isolated and cultured by 3D organoid culture system to explore the role of silica-induced activation of NLRP3 inflammasome in lung organoid formation, lung stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition (EMT). Finally, the important signaling involving the regulation of lung epithelial stem cell’s functions, such as Wnt, Notch, and Shh, will be studied to uncover the mechanisms for NLRP3 inflammasome-mediated lung regeneration. The potential results will greatly improve the current knowledge of the biological functions of NLRP3 inflammasome as well as the pathogenic mechanisms for silicosis, and provide theory basis and experimental evidence for a new way to prevent and treat silicosis via regulation of lung regeneration targeting at NLRP3 inflammasome.

导致矽肺形成的二氧化硅晶体微粒是公认的NLRP3炎症小体激活剂。气道上皮再生在呼吸疾病的恢复中发挥重要作用。然而，对于NLRP3炎症小体在气道上皮再生中的作用尚不清楚。本课题首先研究二氧化硅诱导的小鼠肺损伤模型中远端气道上皮再生的时空变化特征，并采用NLRP3炎症小体抑制剂（MCC950）及NLRP3、Caspase-1基因敲除鼠研究二氧化硅所致NLRP3炎症小体活化对气道上皮再生的影响及其对上皮干细胞微环境的影响。进一步分离细支气管肺泡干细胞，采用3D培养等技术研究二氧化硅诱导的NLRP3炎症小体活化对上皮干细胞类器官形成、气道上皮分化以及间充质化（EMT）的影响，并研究Wnt、Notch、Shh等调控干细胞功能的关键信号转导，从而揭示NLRP3炎症小体调节气道上皮再生的分子机制。预期结果将深化对NLRP3炎症小体生物学特性以及矽肺发病机制的认识，为探索矽肺的治疗方法提供新靶点。

NLRP3炎症小体在组织再生和修复过程中发挥重要作用。申请者前期研究发现，二氧化硅微粒可通过激活气道上皮细胞NLRP3炎症小体诱导上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）参与肺纤维化。基于此，本项目分别构建二氧化硅诱导的小鼠肺类器官损伤和肺纤维化模型，从细胞和整体水平研究二氧化硅诱导的NLRP3炎症小体活化在肺损伤及再生性修复中的作用及机制。离体水平研究发现，在2D-类气道上皮模型中，二氧化硅持续刺激可诱导NLRP3炎症小体活化、细胞焦亡、上皮结构破坏，伴有粘液分泌增多、纤毛分布异常；此外，纤毛相互堆叠、缠绕，正常形态发生改变，部分纤毛发生质膜融合，丧失正常微管结构，并进一步导致运动功能障碍；二氧化硅诱导的NLRP3炎症小体活化可促进上皮细胞增殖、EMT、基底细胞异位分布及干细胞异常修复；炎症相关信号通路（NF-κB）及再生与修复相关信号通路（Shh-Gli、Wnt/β-catenin）蛋白表达水平升高；在3D-类器官损伤模型中，二氧化硅持续刺激可诱导类器官白细胞介素-1β、凋亡相关斑点样蛋白表达水平升高、焦亡细胞增多，进一步导致类器官分化障碍，同时增殖、再生能力降低。而以上效应均可被NLRP3炎症小体抑制剂MCC950改善。整体水平研究发现，小鼠气道内滴注二氧化硅后肺功能进行性破坏；滴注后第7、28和56天，远端肺NLRP3炎症小体活化、支气管肺泡连接区焦亡细胞增多，且炎症水平逐渐降低而纤维化表现逐渐加重；二氧化硅滴注后支气管肺泡连接区粘液分泌及EMT水平进行性升高，第56天最为明显；造模后第7天，远端肺可见干/祖细胞标志物SOX2、SOX9时空表达异常及支气管肺泡干细胞异位分布，而第28和56天未见；滴注后第7、28和56天，NF-κB、Shh-Gli及Wnt/β-catenin通路蛋白表达水平均显著升高。而NLRP3炎症小体抑制剂MCC950可改善以上效应，NLRP3基因敲除小鼠造模后也可见不同时期远端肺炎症和纤维化水平降低。以上结果提示，二氧化硅诱导的NLRP3炎症小体持续活化可导致肺组织异常再生和修复；精确调控NLRP3炎症小体活化，促进正常再生性修复，可为相关肺部疾病的治疗提供新的思路。