纳米二氧化硅活化NLRP3炎症小体引起肺部炎症的机制研究

Inhalation of SiO2 nanoparticles may cause pulmonary inflammation. Our previous studies showed that SiO2 nanoparticles could induce ROS production and inflammatory cytokine secretion. Some researches show that the activation of NLRP3 inflammasome plays a great role in pulmonary inflammation, fibrosis and lung cancer caused by air pollutant particles, but the mechanisms are unclear. This project will explore the role of NLRP3 inflammasome activation in the pulmonary inflammation caused by SiO2 nanoparticles and the related mechanisms. RAW264.7 macrophages and Balb/c mice will be used to observe the inflammation caused by SiO2 nanoparticles in vivo and in vitro including pathological changes of lung tissue, cytotoxicity, the expression of NLRP3 inflammasome-related molecules, and cytokine secretion. Then the mechanisms will be discussed in vitro including ROS production, lysosome observation, cathepsin B detection, NF-kB and MAPK signaling pathways activation, NLRP3 inflammasome-related molecules at the transcriptional level and protein level expression. Meanwhile in vitro knock-down NLRP3 gene by RNAi technology will be used to clarify the role of NLRP3 inflammasome in the inflammatory reactions. This study will provide new perspectives of related mechanisms of inflammation caused by SiO2 nanoparticles, and of the toxicity and safety evaluation of particulate matters.

纳米SiO2经呼吸暴露可引起肺部炎症，课题组前期研究发现纳米SiO2可诱导ROS并引起炎症因子释放，现有研究表明NLRP3炎症小体的活化可能在空气污染物颗粒造成肺部炎症、纤维化和肿瘤的发生中具有重要作用，但具体机制不清。本课题将研究NLRP3炎症小体的活化在肺部炎症中的作用及其机制，分别采用RAW264.7细胞和BALB/c小鼠为作为体外和体内模型，研究纳米SiO2引起炎症反应的过程，包括肺组织病理变化、细胞毒性、NLRP3炎症小体相关蛋白的表达及炎症因子的分泌等。在体外通过ROS水平检测、溶酶体功能、组织蛋白酶B检测、NF-κB和MAPK信号通路活化、NLRP3炎症小体相关分子在转录和蛋白水平的表达进行机制研究，并用RNAi技术knock-down NLRP3基因来进行验证。本课题将从新的角度阐明纳米SiO2引起肺部炎症的相关机制，为颗粒物的毒性和安全性评价提供新的思路。

本研究首先探讨了小鼠体内气管滴注纳米二氧化硅粒子（纳米SiO2）后对主要脏器的影响，通过组织病理和超微结构观察研究了主要脏器的形态和结构变化，进一步，从体外实验研究纳米SiO2对巨噬细胞的影响及探讨相关机制。体内研究探讨气管滴注纳米SiO2在体内对主要脏器引起的炎症损伤，并以肺脏为例，探讨NLRP3炎症小体的活化与炎症的关系。方法：6-8周龄BALB/c雌鼠80只随机分为对照组（生理盐水）、低剂量组（7mg/kg bw）、中剂量组（21mg/kg bw）和高剂量组（35mg/kg bw），非暴露式气管滴注染毒5次，每3天一次，最后一次染毒1天后和15天后取材。血生化检测数据显示实验组球蛋白降低、白球比降低、ALT与AST升高、BUN与Cr升高，但无明显剂量及时间效应；组织形态学观察各实验组的肺、肝、脾和肾组织可见炎症及损伤表现，存在剂量依赖效应，15天后这些损伤表现有减轻的趋势；免疫组化结果显示染毒结束后1天肺组织表达IL-1β具有剂量依赖性；ELISA检测肺组织实验组MCP-1显著升高，有明显剂量依赖应，IL-18和TNF-α也有相应升高；肺组织氧化损伤指标变化不显著；WB结果显示实验组NLRP3、P-NF-κB与IL-1β表达增多。结论：气管滴注纳米SiO2可引起体内炎症，诱导炎症因子分泌，引起肺组织的轻微氧化损伤作用，并且可能通过活化NF-κB信号通路调控NLRP3表达增多引起IL-1β分泌，引发炎症反应。体外研究使用RAW264.7细胞，设为阴性对照组、5μg/ml染毒组、10μg/m染毒组、20μg/m染毒组,染毒24h。结果：染毒组细胞镜下观察与阴性对照组相比较，细胞密度减少且形态发生明显不规则改变；氧化损伤实验测得数据显示，阴性对照MDA、LDH活性低于阳性对照组与染毒组，SOD、GSH-Px、CAT活性高于阳性对照组与染毒组。WB实验测定与阴性对照组相比，阳性对照组与染毒组NLRP3、IL-1β与NF-κB含量上升。结论：纳米SiO2具有细胞毒性可以引起巨噬细胞的形态改变、吞噬功能降低以及氧化应激损伤，且可能通过活化NF-κB调控NLRP3增多引起IL-1β分泌，引发炎症反应。以上结果表明，纳米SiO2被巨噬细胞吞噬后，可通过活化NLRP3炎症小体，引起炎症因子分泌，从而参与体内的局部和系统性炎症。