杀鱼爱德华氏菌侵染宿主上皮细胞分子机制研究及靶向侵染关键基因的减毒疫苗设计

Edwardsiella piscicida has been recognized as one of the leading pathogens to freshwater and marine cultured fish worldwide. The live attenuated vaccine target for the key virulent genes fail to evoke the host mucosal immune system by immersion vaccination. In order to develop effective live attenuated immersion vaccine, the selection of new targets are important. E. piscicida was an intracellular pathogen which can invade and repilicate within epithelial cells, most antibiotics and inactivated vaccine were not effective. It is suggested that knocking out the genes involved in invasion instead of the key virulence genes might evoke the host mucosal immue system. In this project, we intend to screen and identify E. piscicida key adhesion and internalization genes, analyse the function of E. piscicida adhesion and internalization factors, and evaluate the potential of adhesion and internalization factors as targets for live attenuated vaccine design. Our work will elucidate the detailed invasion mechanism of E. piscicida to epithelial cell and greatly benefit the live attenuated vaccine design of immersion vaccination.

杀鱼爱德华氏菌是重要的海洋鱼类病原，已有的细菌减毒疫苗由于缺失了关键毒力因子，在浸泡免疫条件下无法有效激活宿主粘膜免疫系统。因此，为了开发有效的浸泡型细菌减毒活疫苗，寻找新的毒力基因靶点是疫苗设计的关键。杀鱼爱德华氏菌能够入侵宿主上皮细胞，在胞内增殖复制后实现扩散感染。由此我们提出：在不破坏细菌关键毒力因子的情况下，切断细菌入侵宿主上皮细胞的分子途径，将胞内病原暴露于宿主的胞外免疫监控系统之下，将有助于激活宿主的粘膜免疫系统。为了实现上述设想，本项目拟系统鉴定杀鱼爱德华氏菌入侵宿主上皮细胞的关键基因，解析关键黏附、内化因子在细菌入侵过程中的分子机制，并基于黏附/内化关键基因进行减毒疫苗的理性设计。本项目的成功实施将有助于阐明杀鱼爱德华氏菌入侵宿主上皮细胞的分子机制，开发安全高效的细菌减毒活疫苗，为水产养殖病害的免疫防控打下基础。

杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)是水产养殖业中危害极大的革兰氏阴性兼性胞内寄生菌。杀鱼爱德华氏菌为胞内寄生菌，它的感染过程可以简化为三步：黏附、内化以及胞内增殖。针对不同的感染过程，杀鱼爱德华氏菌都有相关的调控因子和调控机制来促进它的感染。本项目基于一个杀鱼爱德华氏菌转座子插入突变体文库，首先筛选了影响杀鱼爱德华氏菌在ZF4细胞上感染效率的基因，在得到39个候选基因后我们进一步考察了这39个基因对杀鱼爱德华氏菌黏附、内化、胞内增殖三个感染过程的影响，最终得到5个能调控杀鱼爱德华氏菌在ZF4细胞上感染的基因（ETAE_0879，ETAE_1010，ETAE_0399，ETAE_0354和ETAE_2148）。其中ETAE_1010和ETAE_0354调控杀鱼爱德华氏菌在ZF4细胞上的黏附，ETAE_0879，ETAE_0399和ETAE_2148调控杀鱼爱德华氏菌在ZF4细胞上的内化，ETAE_0399调控杀鱼爱德华氏菌在ZF4细胞上的胞内增殖。进一步探究发现，ETAE_0399编码杀鱼爱德华氏菌中的一种蛋白酶，和其他病原菌中的FtsH有高度的同源性。首先，我们发现ETAE_0399的缺失不影响杀鱼爱德华氏菌的生长，同时，在HeLa细胞上ETAE_0399影响杀鱼爱德华氏菌的黏附、内化以及胞内增殖，但在ZF4细胞上，ETAE_0399只调控杀鱼爱德华氏菌的胞内增殖。此外，在斑马鱼上，ETAE_0399能够影响杀鱼爱德华氏菌的毒力，并且ETAE_0399是杀鱼爱德华氏菌在斑马鱼脏器定殖所需要的。通过本项目的研究确定了杀鱼爱德华氏菌调控感染的关键基因，为后续进一步研究杀鱼爱德华氏菌的感染机制奠定了基础。此外，初步考察了几个侵染调控基因突变株作为减毒疫苗候选株的可行性，为后续减毒疫苗株的构建和筛选奠定了基础。