肝细胞和巨噬细胞特异性阻断Notch信号对肝纤维化的不同作用及其机制研究

Liver fibrosis is a repeated wound-healing response, which involves liver regeneration after injury, hepatic stellate cells activation and chronic inflammation especially macrophage inflammatory response. Notch signaling pathway, which is conserved through evolution, plays an important role in these aspects. However Notch's role in liver fibrosis remains unclear. At the previous work, the applicant conducted an exploratory study on the RBP-J knockout mice (RBP-J is a common transcriptional factor of the classical Notch signaling). We found that systemic RBP-J knockout lead to increased liver fibrosis and macrophage specific RBP-J knockout lead to decreased liver fibrosis, which is different from previous report. We infer that the different effects of systemic and macrophage-specific Notch blockade in liver fibrosis may be caused by different response of Notch blockade in different cell types, such as promoting apoptosis or inhibiting proliferation in hepatocytes, inhibiting the expression of inflammatory cytokines in macrophages. On the basis of the preliminary work, this project intents to clarify Notch's role in liver fibrosis in different cell types, downstream molecular and its regulatory mechanism using tissue-/cell-specific RBP-J knockout mice. This study will provide potential molecular targets for the treatment of liver fibrosis or new cell therapy method, is of great significance.

肝纤维化是反复的伤口愈合反应，涉及肝损伤再生，肝星状细胞活化，慢性炎症反应尤其是巨噬细胞的应答等方面的相互作用，而Notch信号在这几方面都发挥重要作用，但Notch信号在肝纤维化中的作用仍不清楚。申请者前期在经典Notch信号转录因子RBP-J基因敲除小鼠上进行探索性研究，发现与以往研究不同，全身Notch阻断加重肝纤维化，而巨噬细胞特异Notch阻断减轻肝纤维化，我们推测两种截然相反作用的原因可能是由不同细胞群Notch阻断对肝纤维化的作用不同造成，肝细胞Notch阻断细胞增殖减弱凋亡增加而加重肝纤维化，而巨噬细胞Notch阻断炎症因子表达降低而减轻肝纤维化。本项目拟在前期基础上，利用组织细胞特异性RBP-J基因敲除小鼠，明确各细胞群Notch阻断对肝纤维化的作用，阐明Notch信号作用的下游分子及其调控机制。这项研究将为肝纤维化治疗提供潜在的分子靶点或细胞治疗的新方案，具有重要意义。

肝纤维化是慢性炎症参与的损伤修复的反应，特别是肝细胞和巨噬细胞，在肝纤维化发生发展过程中发挥重要功能。Notch信号是进化上高度保守的信号途径，四种Notch受体共同激活核心转录因子为RBP-J。研究表明RBP-J介导的Notch信号在肝脏慢性疾病中起重要作用。但到目前为止，体内肝细胞、巨噬细胞Notch信号对肝纤维化的作用仍然不清楚。.我们主要进行了如下几方面的研究：.1.在Lyz2-Cre 或Alb-Cre RBP-J(flox/flox)和对照小鼠上建立四氯化碳、胆管结扎肝纤维化模型。.2. HE、Masson、Sirius Red和αSMA等肝脏组织学染色检测肝脏炎性细胞浸润、纤维化水平。 .3.实时定量PCR、ELISA检测肝脏及血清肝纤维化相关因子，如TGFβ1，PDGF-B，炎症相关因子如TNFα，IL1β，IL6等的表达。.4.流式细胞技术、实时定量PCR、免疫荧光染色和蛋白印迹等技术检测肝巨噬细胞，肝细胞NFκB通路、JAK2-STAT3、Erk1/2的变化及圆柱瘤基因Cyld变化。.5.肝巨噬细胞上清与原代肝星型细胞（HSCs）共培养实验检测不同处理巨噬细胞上清对HSCs的增殖和胶原表达的影响。.6.在人肝硬化标本中检测Notch信号、Cyld的表达。.结果：我们发现巨噬细胞特异性RBP-J缺陷能够削弱小鼠肝纤维化，PDGF-B和TGFβ1等促纤维化因子分泌减少，肝脏中炎性细胞浸润和炎性因子的表达减少。进一步的分子机制研究发现RBP-J缺陷的巨噬细胞NFκB信号减弱，同时Erk1/2的磷酸化降低，这很可能与其负调节因子Cyld水平上升有关。而在巨噬细胞中敲低Cyld或（和）过表达p65则能挽救因RBP-J缺陷而削弱的炎症应答，挽救RBP-J缺陷而减弱的HSCs的增殖和胶原表达。同时我们在肝硬化临床标本中验证肝硬化水平与Notch信号激活正相关，与Cyld的表达呈负相关。与之相反，Notch信号通过JAK2-STAT3保护肝细胞，肝细胞特异的RBP-J缺陷导致肝纤维化加重。