基于单细胞全基因组扩增及突变分析的α-和β-地中海贫血植入前遗传学诊断

Preimplantation genetic diagnosis(PGD) can be applied for healthy embryos selection before implanted in the womb, then avoid pregnancy of severe children and injure caused by selective abortion. It is an effective preventive measure for genetic disease such as thalassemia.Current status of thalassemia PGD is less detection sites, low technology level and low success rate. In this study, single-cells of polar body and blastomere will be selected as detect objects. The multiple displacement amplification technology which suitable for whole genome amplification of high GC content and complex secondary structure templates will be established. The follow-up gene mutation detection methods which based on target gene copy number direct quantitation and fluorescent labeling target fragment capillary electrophoresis will be developed. Meanwhile, the pedigree analysis of globin gene linked STR and SNP polymorphism will also be utilized to set up measures for DNA pollution and allele drop-out.After methodology evaluation by clinical samples testing,we will set up a new standard technique system of single-cell whole genome amplification and mutation analysis for thalassemia PGD which based on polar body and blastomere. With this technique system, the synchronous detection of α-and β-gene deletional and point mutations in thalassemia PGD can be realized. The restriction of technical level and standard degree of thalassemia PGD will be effectively solved, and then the routine clinical application of thalassemia PGD will be promoted. This research can also provide reference for PGD research of other genetic disease.

采用植入前遗传学诊断(PGD)优选健康胚胎植入子宫，可避免重症患儿妊娠及选择性流产或引产所致创伤，是地中海贫血(地贫)等遗传病的有效预防措施。针对当前地贫PGD检测位点少、技术水平和成功率低的现状，本研究以极体和卵裂球单细胞为检测对象，研发适用于高GC和复杂二级结构模板的单细胞全基因组多重置换扩增方法；并建立基于目的基因拷贝数直接定量和荧光标记片段毛细管电泳分析技术的后续基因突变检测方法，以及采用珠蛋白基因连锁STR和SNP多态性位点家系分析的DNA污染和等位基因脱扣现象解决方案与质控措施。通过临床样本检测的方法学评价，形成"基于极体和卵裂球单细胞全基因组扩增及突变分析的地贫植入前遗传学诊断标准化新技术体系"，实现 α-和β-基因缺失突变与点突变的PGD同步检测，有效解决地贫PGD技术水平和规范化程度限制而促其实现临床常规应用；也可为其它遗传病的PGD研究提供借鉴与参考。

植入前遗传学诊断（PGD）可从妊娠的源头上实现优生，避免了传统产前诊断的创伤性取样、流产或引产手术。地贫PGD检测流程的可操作性，以及检测方法的灵敏度与准确性，一直以来是我们面临的主要任务。目前的PGD流程是通过对单一或少数几个细胞进行全基因组扩增（WGA），进而采用相应的DNA分析方法进行待检基因分型。普遍存在WGA不平衡、等位基因脱扣（ADO）、后续基因分方法局限等问题。.本研究①以β-地贫为疾病模型，采用经典多重置换扩增（MDA）和新近研发的多次退火环状循环扩增（MALBAC）技术为基础，通过SNP/CNV分析和基因分型，评价两种方法的优缺点，从而选择一种最适于β-地中海贫血PGD的全基因组扩增方法；②以α-地贫为疾病模型，建立高GC复杂模板全基因组扩增及后续基因分型的PGD策略。.收集11例β-珠蛋白基因突变携带者的外周血、7种β-珠蛋白基因突变纯合和双重杂合的永生化细胞株以及14例夫妇至少一方为β-地贫基因携带者卵裂期或囊胚期废弃胚胎为研究材料；分别活检单个外周血淋巴细胞或卵裂球以及5个淋巴细胞株细胞或囊胚滋养外胚层细胞；平行采用MDA和MALBAC进行全基因组扩增，一代测序β-地贫基因分型；并采用二代测序检测单核苷酸多态性（SNP）和拷贝数变异（CNV），以通过连锁分析排除ADO误诊，统计分析突变位点检测成功率、ADO、阳性预测值和敏感性。另外，基于MDA技术，建立了一种适用于高GC和复杂二级结构α珠蛋白基因模板的目标序列扩增方法，以及后续的荧光标记探针基因突变检测方法。.β-地贫PGD研究结果显示MDA和MALBAC分别在SNP和CNV分析中占优势，而MDA的ADO发生率低，说明基于MDA技术的β-地贫PGD检测体系准确性更高，并可实现β-地贫和染色体疾病同步诊断且避免ADO导致的误诊。α-地贫PGD研究结果提示高GC和复杂二级结构区域的扩增不平衡是影响检测成功率的关键因素之一，目标序列特异扩增结合后续敏感基因分型方法是解决此问题的有效策略之一。