禽源H1N1亚型流感病毒NA和M基因对重组猪流感病毒生物学特性的影响

NA and M genes of 2009 pandemic H1N1 virus originated from the avian origin H1N1 subtype swine influenza virus, while other genes came from the triple reassortant H1N2 subtype swine influenza virus. Before the outbreak of 2009 pandemic H1N1 influenza, the avian origin H1N1 and triple reassortant H1N2 subtype swine influenza viruses sporadically infected humans, but they did not cause an influenza pandemic. So NA and M genes of 2009 pandemic H1N1 virus might affect its replication, pathogenicity, transmission, and other biological characteristics. Previously the avian origin H1N1 and triple reassortant H1N2 subtype swine influenza viruses have been isolated from pigs in China. In this study, the reverse genetics technology platform of the triple reassortant H1N2 subtype swine virus will be built firstly. Then a series of recombinant viruses containing the NA and M genes of avian origin H1N1 swine virus will be rescued. Finally the biological characteristics of these reassortant viruses, such as growth characteristics in vitro, plaque morphology, neuraminidase activity, virus morphology, replication and pathogenicity in mice, and the ability to transmit in guinea pigs, will be investigated. Our study will further explain the mechanism of swine influenza virus replication, pathogenesis, and transmission.

甲型H1N1流感病毒NA和M基因起源于禽源H1N1亚型猪流感病毒（SIV），其它基因起源于三源重组H1N2亚型SIV。在甲型H1N1流感爆发之前，禽源H1N1亚型和三源重组H1N2亚型SIV曾零星感染人类，但并未引起流感大流行，由此推测甲型H1N1流感病毒NA和M基因可能影响其复制、致病、传播能力等生物学特性。国内猪群中流行的禽源H1N1亚型SIV的NA和M基因（非甲型H1N1流感病毒NA和M基因，二者起源相同）对重组SIV的生物学特性有何影响，这是一个未知数。本研究以此为出发点，结合我们前期在国内猪群中分离到的禽源H1N1亚型和三源重组的H1N2亚型SIV，搭建三源重组H1N2亚型SIV的反向遗传操作技术平台，拯救含禽源H1N1亚型SIV的NA和M基因的重组SIV，研究禽源H1N1亚型SIV的NA和M基因对重组SIV生物学特性的影响，为解析SIV的复制、致病及传播机理奠定基础。

2009年在全球爆发的甲型H1N1 流感病毒NA 和M 基因起源于禽源H1N1 亚型猪流感病毒（SIV），其它基因起源于三源重组H1N2 亚型SIV。在甲型H1N1 流感爆发之前，禽源H1N1 亚型和三源重组H1N2 亚型SIV 曾零星感染人类，但并未引起流感大流行，由此推测2009甲型H1N1 流感病毒NA 和M 基因可能影响其复制、致病、传播能力等生物学特性。本研究我们首先以国内SIV分子流行病调查分离到病毒为材料，进行了三源重组H1N2亚型SIV（S12）和欧洲禽源H1N1亚型SIV（Z11）序列的精确测定及分子遗传演化分析，验证并确定了SIV分离株S12的PB2、PB1、PA、NP、HA和NS基因与甲型H1N1流感病毒的分子进化相关性，同时也验证并确定了SIV分离株Z11的NA和M基因与甲型H1N1流感病毒的分子进化关系；接下来我们以S12为试验材料，将S12八个基因片段成功克隆至双向载体PBD中，构建S12八个基因重组质粒，纯化质粒转染293T细胞并接种MDCK细胞后，能够检测到具有血凝活性的流感病毒，拯救到的病毒序列与原始野生株一致，从而表明我们成功建立了三源重组H1N2亚型SIV的反向遗传操作技术平台；同样我们以Z11为试验材料，构建NA和M基因的重组质粒，利用成功建立的S12反向遗传操作技术平台，快捷地进行了重组SIV的拯救，成功获得了系列含禽源NA和M基因的重组病毒。最后我们以不同细胞（犬肾细胞MDCK、人肺腺癌细胞A549及猪肾细胞PK-15）、小鼠及豚鼠为模型，评价欧洲禽源H1N1 亚型SIV 的NA 和M 基因对重组SIV 生物学特性的影响，体内外研究数据表明，欧洲禽源H1N1亚型SIV的NA和M基因能在体内外（MDCK、A549、PK-15及小鼠）导致重组病毒的复制能力增强，并能在豚鼠间有效地接触传播，进而揭示了禽源H1N1亚型SIV的NA和M基因在SIV复制、致病性及传播方面所发挥的重要作用，为2009甲型H1N1流感病毒的致病及传播机制提供了科学补充数据。