多酶体系的定向共固定化：亲和LB膜法和共辅基法

Multienzyme system can catalyze a wide variety of metabolic processes, which involve multiple reaction steps. After immobilization, enzyme always lost its activity largely. To avoid this drawback, oriented immobilization of enzyme is regarded as an efficient method. In our work, two novel methods of the oriented co-immobilization of multienzyme system with higher enzyme activity are presented, affinity Langmuir-Blodgett and co-prosthetic group. For affinity Langmuir-Blodgett method, a ligand which can form affinity interaction with the activity site of enzyme, is modified with a long carbon chain. Then, the modified ligand is used to prepare a single molecular film on the water/air surface. After that, the enzyme form affinity interaction with the film. Last, the enzyme is transferred to support to obtain the multienzyme system of oriented co-immobilization. For co-prosthetic group method, which is efficient for biosensor to directly contact the active site of enzyme with electrode, the molecular structure of conductive polymer is designed to co-immobilize prosthetic group, and the molecular weight of this conductive polymer is control to tailor the distance of enzymes. This work would be helpful to provide theory found for the oriented co-immobilization of multienzyme system with higher enzyme activity and biofunctional materials containing other biomolecules (sucha as DNA and antibody).

多酶共固定化技术能充分发挥不同酶的特点，连续催化多步反应。但固定化后，酶活性中心取向不易控制，酶活性损失显著，将酶进行定向固定化是解决这一问题的有效方法。为此，申请人提出了两种新型的酶定向共固定化方法，亲和LB膜法和共辅基法。亲和LB膜法选择与酶活性中心具有亲和作用的分子，对其改性使其具有表面活性，制备单分子膜。通过亲和作用，酶分子选择性定向结合在单分子膜下。将酶分子转移到载体，得到酶催化活性中心向外的固定化酶。这种方法易于实现多酶体系的定向共固定化，达到连续催化的目的。对于生物传感器，希望酶催化活性中心直接与电极接触。对此，可采用共辅基法，即将几种辅基共固定化于一个导电高分子上，通过控制导电高分子的分子量精确调控酶分子间的距离，实现多酶体系协同效应。本项目为设计制备高活性定向固定化多酶体系提供了理论依据，对DNA和抗体等生物活性大分子固定化也具有重要的借鉴意义。

多酶体系可以连续催化多步反应，具有重要的研究意义和应用价值。但多酶体系固定化后，酶活性中心取向不易控制，酶活性损失显著。为此，本研究提出将酶进行定向固定化可以解决这一问题，采用了两种新型的酶定向共固定化方法，亲和LB膜法和共辅基法。亲和LB膜法选择与酶活性中心具有亲和作用的分子，对其改性使其具有表面活性，制备单分子膜。通过亲和作用，酶分子选择性定向结合在单分子膜下。将酶分子转移到载体，得到酶催化活性中心向外的固定化酶。这种方法易于实现多酶体系的定向共固定化，达到连续催化的目的。对于生物传感器，希望酶催化活性中心直接与电极接触。对此，可采用共辅基法，即将几种辅基共固定化于一个导电高分子上，通过控制导电高分子的分子量精确调控酶分子间的距离，实现多酶体系协同效应。实验结果表明采用定向共固定化多酶体系的活性比一般的无规共固定化多酶体系的活性显著提高。通过对酶分子结构测试表明，这主要是由于定向共固定化多酶体系的分子构象得到了良好的保留，从而使多酶体系的活性提高。同时，多种酶分子活性中心高度取向，有利于酶分子级联反应的高效进行，也有利于提高多酶体系的催化活性。这一研究结果，可以有效提高多酶体系的活性，在生物传感器和生物反应器等领域具有重要的科学意义和应用价值，对于抗体等蛋白质类生物活性分子的固定化也具有重要的借鉴价值。