大肠杆菌肽聚糖水解酶LdcA 的结构与功能研究

Peptidoglycan (PG) is an essential component of the bacterial cell wall and takes participate in many physiological processes such as cellular morphogenesis, cell growth and cell division. In growing E. coli cells, PG synthesis is associated with a 40 to 50% turnover per generation of the cell wall PG. LdcA plays a key role in PG turnover and reclying. To date,its cleavage site and the substrate specifity were widely studied.However,the molecular catalytic and inhibitory mechanismes of LdcA are still unknown. The project is aimed to determine the 3D structures of the native protein and the complexes with their substrate and inhibitor using X-ray crystallography and then identify the active site and the inhibitor binding site via structure comparison/analysis and site-directed mutagenesis. Accordingly, the relationships between structure and function were demonstrated, and the molecular and inhibitory mechanisms were revealed. Additionally, because PG hydrolase LdcA may become a potential target of antibiotics, the results got from this project could give useful clues for antimicrobial drug designation.

肽聚糖是微生物细胞壁的主要组成部分，参与细胞的形态发生、生长与分裂等多种重要的生理过程。在大肠杆菌中，大约40%-50%的肽聚糖在水解之后，其产物都能够被循环再利用重新形成肽聚糖。肽聚糖水解酶LdcA在肽聚糖的循环再利用过程中发挥重要作用。目前，LdcA的底物特异性和作用位点已得到比较详细的研究，但其在分子水平上的催化反应机理及小分子抑制剂对它的抑制机制尚未得到阐述。本项目拟运用X射线晶体学的方法系统的测定LdcA及其与底物、抑制剂复合物的三维结构，通过结构比较、分析和定点突变等实验确定其活性位点及抑制剂结合位点，阐明结构与功能的关系，从而揭示LdcA的催化反应机制和抑制剂对LdcA的抑制机理。此外，肽聚糖水解酶LdcA是一种潜在的抗生素类药物靶点，因此，期望本项目能够为新型抗菌药物的设计提供直接的理论指导。

肽聚糖是微生物细胞壁的主要组成部分，在细胞的整个生命活动周期过程中发挥重要作用，参与细胞的形态发生、生长与分裂等多种重要的生理过程。肽聚糖合成酶和肽聚糖水解酶在肽聚糖的组装与解体过程中扮演着重要角色，此外，它们在细胞生命活动的众多过程中也具有重要作用。鉴于此，这就使得肽聚糖合成酶和水解酶的研究具有重要的理论意义。运用X射线晶体学方法，本项目对如下几种在肽聚糖合成、降解途径中的重要蛋白质进行三维结构的测定与功能研究。.（1）本项目对大肠杆菌O157中肽聚糖水解酶LdcA及其多种同源蛋白质进行初步晶体学研究，但未能如愿解析其三维结构；使用同源模建方法构建了LdcA的三维模型，揭示了其潜在的催化氨基酸。.(2)本项目解析了大肠杆菌O157中天冬氨酸/谷氨酸消旋酶EcL-DER及其与底物、产物复合物的晶体结构；阐述了活性中心的结构，首次提出不对称催化对（Thr-Cys）的存在，并揭示了氨基酸消旋酶不对称催化对的普遍存在与高度保守性；从结构生物学角度建立了EcL-DER单向消旋反应的催化反应机制模型。.（3）本项目解析了大肠杆菌O157中胞壁质-三肽酰胺酶MpaA的晶体结构；对活性中心进行结构分析，揭示了MpaA的催化反应过程；Tyr133-Asp143 loop远离MpaA核心结构，负责调解底物的进入与结合；Val204-Thr211 loop决定了活性中心入口的体积，继而影响底物结合特异性。.此外，在已获得大肠杆菌DyP型过氧化物YfeX三维结构的基础之上，本项目对YfeX的生化功能进行研究，分析其活性中心结构，揭示了辅因子H2O2进入的路径；并使用多种底物对YfeX的酶学特性进行检测，验证了活性中心氨基酸的催化功能与底物类型密切相关。.本项目在分子水平上阐述了EcL-DER、MpaA和YfeX的催化反应机理。由于这些蛋白质是潜在的抗生素类药物靶点，因此，本项目能够为新型抗菌药物的设计提供直接的理论指导。