心外膜脂肪外泌体miR-199a-3p在糖尿病心肌代谢异常中的机制研究

The energy metabolism disorder of cardiac myocytes is the primary link in the cause of diabetic cardiomyopathy. Epicardial adipose tissue (EAT) is closely related to diabetic cardiomyopathy, but the regulatory mechanism is still unclear. Exosome can load a variety of miRNA to regulate cardiovascular disease. We found that, 1) EAT of patients with diabetes secrete exosomes can inhibit the expression of FASN, GLUT4 and PGC1-α on primary myocardial cells, significantly induced mitochondrial ROS increased, and further lead to myocardial mitochondria injury; 2) by microarray analysis，found miR-199a-3p of primary EAT cell exosomes significantly increased,and biological information analysis found miR-199a-3p was related to glucose utilization and mitochondrial function of cardiomyocytes. Therefore, we hypothesized that the secretion of miR-199a-3p rich exosome from diabetic EAT caused the fatty acid, glucose utilization disorder and mitochondrial damage of cardiomyocytes, resulting in diabetic cardiomyopathy. This project is going to use lentivirus transfection, luciferase reporter technology in vivo and vitro, and knockout db/db mice EAT miR-199a-3p to explore the regulation role of exosome miR-199a-3p on myocardial metabolism.

心肌细胞能量代谢障碍是糖尿病心肌病重要机制。心外膜脂肪（epicardial adipose tissue，EAT）与糖尿病心肌病关系密切，但机制不清楚。外泌体可负载多种miRNA调控心血管疾病。前期研究发现：1）糖尿病患者EAT外泌体抑制原代心肌细胞FASN、GLUT4、PPARγ及PGC1-α表达，增加线粒体ROS，导致线粒体损伤；2）芯片检测发现糖尿病小鼠原代EAT细胞上清外泌体miR-199a-3p显著上调，生物信息学分析miR-199a-3p可能参与调控心肌细胞葡萄糖利用及线粒体功能。因此，我们提出假设，糖尿病EAT分泌富含miR-199a-3p外泌体引起心肌细胞代谢异常。本项目拟从在体和细胞水平，采用慢病毒转染、荧光素酶报告基因等技术，并敲除db/db小鼠EATmiR-199a-3p探讨EAT外泌体miR-199a-3p对糖尿病心肌代谢调控作用。

项目背景：.糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy，DCM）起病隐匿，最初特征为心肌能量代谢异常、纤维化、重构导致心肌舒张功能障碍，最终进展为难治性心力衰竭。脂肪组织是体内最大的内分泌器官，在糖尿病器官并发症中起到重要作用。心外膜脂肪组织（epicardial adipose tissue，EAT）与心室肌细胞紧密连接。研究证实EAT分泌产物与糖尿病相关心脏病密切相关。EAT源性miRNA如何调控心肌细胞代谢机制尚不清楚。.主要研究内容：.将高糖培养脂肪细胞外泌体及糖尿病大鼠EAT组织进行miRNA测序，外泌体荧光标记PKH26，Mito SOXTM Red染色检测线粒体ROS生成，再利用Real time RT-PCR和Western-blot等方法检测各组心室肌细胞代谢调控因子。过表达或沉默脂肪细胞外泌体miR-199a-3p，基于MRM方法的靶向代谢组学分析、seahorse检测细胞外酸化率(ECAR)和细胞耗氧率(OCR)功能等检测心肌细胞能量代谢变化。荧光素酶报告基因验证miR-199a-3p直接作用靶基因MAP3K11。.重要结果及关键数据：.高糖培养脂肪细胞细胞外泌体可引起心室肌细胞糖脂代谢降低。抑制脂肪细胞外泌体miRNA分泌可部分缓解高糖培养脂肪细胞外泌体对心肌细胞糖脂代谢关键蛋白的抑制作用。外泌体miRNA测序结果显示，正常培养基与高糖培养基培养的脂肪细胞外泌体差异性表达miRNA 15个，其中miR-199a-3p上调明显，ZDF大鼠EAT miRNA测序发现差异表达miRNA 90个，同样miR-199a-3p上调明显。脂肪细胞外泌体miR-199a-3p抑制葡萄糖和脂肪酸分解代谢，增加线粒体ROS含量（图6 A，图7A），损伤线粒体呼吸功能，使细胞ATP含量降低，从而影响心肌细胞功能。荧光素酶报告基因检测证实miR-199a-3p可直接结合目的基因MAP3K11。.科学意义：.研究证实脂肪细胞外泌体miR-199a-3p可显著抑制心肌细胞葡萄糖和脂肪酸分解代谢，影响葡萄糖和脂肪酸代谢关键蛋白，增加线粒体ROS含量，抑制线粒体呼吸功能。以上结果提示，糖尿病患者EAT可以通过分泌富含miR-199a-3p调控心肌细胞代谢，促进糖尿病心肌病发生发展，而循环外泌体miR-199a-3p可以做为糖尿病心肌病预警因子。