钙离子通道CaBP4基因突变在夜发性额叶癫痫的致痫机制研究

Autosomal dominant vaginal frontal lobe epilepsy (ADNFLE) is a family of hereditary epilepsy syndrome that is easily misdiagnosed, and the pathogenesis has not been elucidated so far. More than ten years of research suggests that the known mutations in pathogenic genes can only explain a very small number of families, most of the genetic background of the family has not yet known, suggesting that there may be another important new genes. In this study, we found that there was a new missense mutation G155D of CaBP4 gene in a study of a 4-generation Chinese ADNFLE family, and a preliminary test in the patch clamp suggested that the mutation could cause rat hippocampal neurons The frequency of action is increasing, so we have reason to speculate that CaBP4 gene mutation is likely to be the new pathogenic gene of this disease. In this project, we will further expand the case to confirm the presence of CaBP4 gene mutation in ADNFLE population. At the same time, the effects of CaBP4 gene mutation on neuronal excitability and the regulation of ion channels were studied by using cell biology and molecular biology Mechanism to clarify the epileptic mechanism of CaBP4 gene mutation in the pathogenesis of ADNFLE, and to provide scientific basis and new target for the early diagnosis, treatment and drug development of this disease.

常染色体显性遗传夜发性额叶癫痫（ADNFLE）是一个极易被误诊的家系遗传性癫痫综合征，至今发病机制仍未阐明。十余年的研究提示目前已知的致病基因突变仅能解释极少数的家系，大部分家系的遗传背景尚未得知，这提示可能存在另为重要的新致病基因。本项目基于前期已对一个4代发病的中国ADNFLE大家系的研究中，发现存在一个钙离子通道CaBP4基因的新错义突变G155D，且在膜片钳初步试验提示该突变可引起大鼠海马神经元动作电位发放频率增加，因此我们有理由推测CaBP4基因突变很可能是本病的新致病基因。本项目将拟进一步扩大病例收集以验证ADNFLE人群存在CaBP4基因突变，同时运用细胞生物学和分子生物学实验技术，结合电生理技术研究CaBP4基因突变对神经元兴奋性的影响及其离子通道的调控机制，旨在明确CaBP4基因突变在ADNFLE发病中的致痫机制，为本病的未来早期诊断、治疗及药物开发提供科学依据及新靶点。

CaBP4基因编码钙离子结合蛋白4，该蛋白在多种神经元细胞中通过结合Ca2+来发挥调控作用，精确地调控细胞内钙离子浓度。本课题通过细胞培养及转染，CRISPER/cas9（DNA剪接技术）等技术成功构建了CaBP4基因野生型及突变型的细胞模型和动物模型，结合运用生物信息学、蛋白质生物化学、细胞电生理学以及动物行为学等方法与技术，对CaBP4基因p.G155D突变型参与引起常染色体显性遗传夜发性额叶癫痫（Autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy，ADNFLE）的致病机制进行了深入研究，并取得了良好的预期成果。首先，课题组构建带有绿色荧光标签的CaBP4基因野生型及突变型重组质粒，通过转染人神经元细胞系获得细胞模型，并通过CRISPER/cas9技术构建CaBP4突变型及野生型动物小鼠模型。接着，通过RT-PCR方法分析CaBP4基因转录水平的表达情况，结果显示CaBP4基因p.G155D突变组转录水平表达量明显增高，分析得出p.G155D突变增加了CaBP4基因的转录量或者引起了CaBP4 mRNA的稳定性的提高的结论。此外，通过Western blot实验分析CaBP4基因蛋白水平的表达情况，结果显示CaBP4基因p.G155D突变组蛋白水平表达情况明显增高，并引起了各脑区蛋白表达水平的不均衡，分析得出p.G155D突变影响了CaBP4蛋白的产生量或者引起了CaBP4蛋白的稳定性的降低的结论。并且，通过膜片钳技术分析神经元细胞微小兴奋性突触后电流的变化情况，结果显示p.G155D突变引起了神经元细胞突触后放电频率的明显加快，进而引起了神经元细胞兴奋性的增高。综上所述，本课题研究表明CaBP4基因p.G155D突变通过影响CaBP4蛋白的功能引起神经元细胞膜电位的变化，进而引起其兴奋性的提高从而导致癫痫，研究结果为探讨常染色体显性遗传夜发性额叶癫痫致病机制奠定了坚实而丰富的工作基础。本项目资助发表核心论文2篇，SCI论文1篇，待发表SCI论文2篇，余少量动物行为学实验部分仍在进行中；课题组培养硕士研究生有6名，其中1名已完成硕士培养，5名在读。项目投入经费20万，目前已用14.7434万，各项支出基本与预算相符。剩余经费5.2566万元，剩余经费计划将继续用于本项目后续研究及论文发表支出。