剪接体蛋白U2AF1突变体在小鼠骨髓微环境调控异常及促进血液肿瘤发生中的作用及机制研究

As an extrinsic event, bone marrow microenvironment takes an important role in regulating hematopoietic stem cell (HSC) growth, differentiation and self-renewal. Changes in bone marrow microenvironment could initiate unbalance of hematopoisis， as well as hematopoietic malignancies development. As a splicing factor, U2AF1 is a key regulator of mRNA transcripts and protein isoforms. U2AF1 mutant, U2AF1S34F, can cause differential splicing of pre-mRNA, affecting biological pathways and cell functions. Based on our previous study that U2AF1S34F has been found in AML patients, in this project, we select U2AF1S34F in bone marrow stromal cells as the breakthrough point of study on the role of abnormal micronenvironment in leukemogenesis. We propose to determine whether U2AF1 mutations in bone marrow stromal cells could cause abnormal splicing of genes and affecting biological pathways of molecules mediated interaction of bone marrow microenvironment and HSC, and further promote leukemogenisis. Via in vitro study of U2AF1S34F mediated abnormal interaction of stroma cells with HSC and construction of U2AF1S34F knock in mice, in which U2AF1S34F specifically expressed in MSC under Prx1 promoter, and investigation of abnormal hematopoisis effects of U2AF1S34F-MSC in U2AF1S34F MSC knock in mice, we would elucidate the contribution of splicing factor mutations of bone marrow stroma cells in abnormal hematopoisis and leukemogenesis, and further define its molecular machanism.

骨髓微环境作为外在因素调控正常造血干细胞的生长发育、分化成熟，微环境调控异常则会引起造血紊乱甚至血液肿瘤的发生。剪接体蛋白U2AF1是选择性剪接的关键分子，其突变体U2AF1S34F可引起细胞内剪接错误从而使细胞功能异常。本项目在白血病患者中发现U2AF1S34F的基础上，以剪接体突变作为研究骨髓微环境促进白血病发生的切入点，探索骨髓基质细胞中的U2AF1S34F是否会引起调控造血的剪接产物异常，进而引起造血调控紊乱及白血病的发生。本项目通过骨髓基质细胞中U2AF1S34F对造血调节作用异常的体外实验研究、Prx1启动子下骨髓间充质干细胞特异表达U2AF1S34F的Knock in小鼠的构建及其造血调控异常研究、U2AF1S34F-MSC Knock in小鼠体内促进白血病发生的二次打击研究，将阐明骨髓基质细胞中剪接体突变在造血调控异常及促进血液肿瘤中发生中的作用，并阐明其分子机制。

剪接体蛋白U2AF1是选择性剪接的关键分子，其突变可引起细胞内错误剪接从而使细胞功能异常。U2AF1S34F是MDS及AML患者中常见的突变体形式，也和患者的预后不良相关。本项目探索骨髓微环境细胞以及造血细胞自身的U2AF1突变在造血细胞功能异常中的作用。通过将U2AF1S34F转染小鼠骨髓间充质干细胞系OP9，发现过表达U2AF1S34F的OP9细胞发生2938个差异剪接事件，引起细胞的线粒体损伤，活性氧的水平增加，诱发细胞内的氧化应激，并引起炎症和趋化因子水平升高，释放H2O2，导致造血细胞基因组不稳定性的增加。表明U2AF1S34F突变引起骨髓基质细胞氧化损伤，进而引起造血细胞的基因组不稳定性。进一步对造血细胞中U2AF1突变在造血细胞异常中的作用研究发现，过表达U2AF1S34F的32D细胞具有一定的生长优势，但并不能脱离对IL-3的依赖；U2AF1S34F 32D细胞活性氧水平升高；RNA-seq分析表明U2AF1S34F 32D细胞中有3001个异常剪接事件，GO分析显示：突变组上调基因富集在蛋白质靶向内质网即蛋白质的合成与转运过程；GSEA分析显示突变组细胞的上调基因显著富集于未折叠蛋白效应（UPR）；并验证发现 U2AF1S34F 32D细胞UPR相关蛋白表达及活化水平明显升高；UPR相关靶基因表达水平上调。UPR的抑制剂处理32D细胞，U2AF1S34F 32D细胞凋亡水平显著增加。同时通过用抑制剂处理携带U2AF1S34F的AML患者的白血病细胞，可显著增加U2AF1S34F患者白血病细胞对Ara-C的敏感性。对U2AF1突变引起的UPR的分子机制研究发现，ROS水平升高是引起UPR的机制之一，此外U2AF1突变蛋白启始翻译相关分子EIF4A2及蛋白运输相关分子 PICAM发生外显子跳跃事件是引起UPR的分子机制，这两个分子也是在携带U2AF1S34F的白血病患者中发生的差异剪接分子。通过本项目研究，阐明了白血病细胞中U2AF1突变引起的细胞功能异常机制，为携带U2AF1突变的白血病患者的提供治疗策略。