MPLL391-V392ins12异常剪接体在骨髓增殖性肿瘤发生中的作用研究

The classic myeloproliferative neoplasms (MPNs) include polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Somatic mutations involving JAK2, MPL or CALR genenomic DNA have recently been discovered to be causative alterations in MPNs. However, a small proportion of patients with MPNs do not harbor any DNA mutations in JAK2, MPL or CALR gene and the molecular basis of these neoplasms remains a mystery. To our knowledge, aberrant splice variants are associated with a potential role in tumor progression. Thus we assumed that aberrant spliceosome in JAK2, MPL or CALR gene might operate in these patients without mutations. Based on this hypothesis, we previously investigated a cohort of patients with MPN. As a result, a novel pathological spliceosome of MPL gene (MPLL391-V392ins12) was identified in MPNs patients without mutations. In this study, functional analysis on MPLL391- V392ins12 will be further performed by vitro and vivo. In details, we will transduct the pathological spliceosome into Ba/F3 cell by lentiviral vector and assess its impact on proliferation of Ba/F3 cell.We will transduct the pathological spliceosome in Balb/C murine by lentiviral vector and observe whether it can lead to MPN in murine models. Collectively, This research is likely to bring an important impact on our understanding of the genetic basis of patients with MPNs.

经典的骨髓增殖性肿瘤（MPN）包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、原发性骨髓纤维化。研究发现JAK2、MPL及CALR基因DNA水平突变是MPN主要分子病因，但仍有部分患者上述三个基因的DNA没有发生突变。异常剪接与肿瘤发生发展密切相关，据此我们猜测上述三个基因是否也存在剪接异常？通过对这类突变阴性MPN患者进行筛查，结果发现了MPL基因一个新的剪接体（命名为MPLL391-V392ins12）。我们已通过人群筛查证实该剪接体是病理性的异常剪接体，且可能是MPN一个新分子病因。本项目中我们将利用慢病毒载体系统将该剪接体转导至Ba/F3细胞，观察其对Ba/F3细胞增殖的影响；利用慢病毒载体系统将该剪接体转导至Balb/C小鼠，观察其诱导Balb/C小鼠致MPN发生的能力，即从细胞和动物两个方面论证其生物学功能。该研究将有助于加深MPN分子发病机制的认识。

骨髓增殖性肿瘤（MPN）是一类以一系或多系髓系细胞包括红系、粒系和巨核系增殖为主要特征的克隆性造血干细胞疾病。其中经典的三类MPN疾病即真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）、原发性骨髓纤维化（PMF）。JAK2、MPL、CALR基因DNA水平突变是引起80～90% MPN患者的分子病因， 但临床上约10～20%的MPN患者上述三个基因的DNA没有发生突变，临床上将此部分患者称为JAK2、MPL、CALR突变三阴性突变MPN（简称〝三阴性MPN〞）。异常剪接与肿瘤发生发展密切相关，据此我们猜测上述三个基因是否也存在剪接异常？本项目前期我们通过对这类突变阴性MPN患者进行筛查，结果发现了MPL基因一个新的剪接体（命名为MPLL391-V392ins12），并通过人群筛查证实该剪接体是病理性的异常剪接体，且可能是MPN一个新分子病因。本项目中我们主要利用慢病毒载体系统将该剪接体及对照基因均分别转导至Ba/F3细胞、NB4细胞、UT7-EPOR细胞，以对其促细胞增殖功能进行探讨。结果发现该剪接体蛋白在小鼠来源的Ba/F3细胞中异常表达于胞浆且不表现有促细胞增殖作用，该结果不同于MPL野生型及常见突变体W515L主要表达于胞膜，且突变体W515L具有显著促细胞增殖作用；同样我们在人源NB4细胞、UT7-EPOR细胞中证实该剪接体蛋白依然表达于胞浆，所有结果提示该剪接体蛋白确实定位于胞浆；另外，利用人源UT7-EPOR细胞进行增殖功能分析发现该剪接体在人源细胞中可表现有促细胞自主增殖作用，同时其蛋白印迹结果显示该剪接体可同MPLW515L突变一样活化JAK2-STAT、PI3K、Erkts通路，使其磷酸化水平增高，提示该剪接体引起人源UT7-EPOR细胞增殖可能与激活这些增殖通路有关。综合目前的结果可以推断该剪接体具有一定的病理功能，但其究竟是否为MPN发病的直接驱动分子，还有待后续动物体内实验进一步阐释。该研究结果可能为三阴性MPN患者提出新的新的分子病因。