家蚕Imd免疫通路受体PGRP及重要信号因子FADD和DREDD的功能研究

The innate immunity of insects includes cellular immunity and humoral immunity. The humoral immune system can activate the Toll pathway (recognizes gram-positive bacteria and fungi) and the Imd pathway (recognizes gram-negative bacteria) to generate relevant antimicrobial peptides to repel entomopathogens. In theory, the immune system can be enhanced to protect economically beneficial insects or destroyed for pest control. Therefore, the study of insect immunity and its signaling pathways is important. The immune system of silkworm is similar to, but different from that of fruit fly. But there have been very few studies on the relevant genes of the silkworm Imd pathway, and the mechanism by which it recognizes entomopathogens is unclear. This project plans to clone the silkworm Imd pathway PGRP receptor and important signaling components FADD, DREDD; analyze their tissue distribution and induced expression; analyze the functional domains; determine the reporter genes; and test its immune responses to gram-positive bacteria, gram-negative bacteria, fungi and viruses. We hope to reveal the molecular mechanisms by which entomopathogens are recognized by the silkworm Imd pathway, and to explore its potential anti-bacterial, anti-fungal and anti-viral abilities. The results will provide theories for genetic engineering and for the breeding of superior strains with greater resistance to entomopathogens. The knowledge of the silkworm Imd pathway will also help to develop biological control approaches against other lepidopteran pests, which has important theoretical and practical values.

昆虫的先天免疫由细胞免疫和体液免疫构成。体液免疫通过激活Toll（识别革兰氏阳性菌和真菌）和Imd（识别革兰氏阴性菌）通路表达相应的抗菌肽来抵御病原微生物。理论上可以通过增强免疫保护经济益虫，通过破坏免疫防治害虫，因此研究昆虫免疫及其信号通路意义重大。家蚕的免疫系统与果蝇相比既相似又有差异，而家蚕Imd通路的相关基因及其识别微生物的机理至今研究的非常少。因此本项目拟克隆家蚕Imd通路的PGRP受体及重要信号因子FADD、DREDD；研究基因的组织和诱导表达；分析功能域；确定报告基因；检测该通路对阳性菌、阴性菌，真菌以及病毒刺激的免疫反应。通过本项目的研究，希望揭示家蚕Imd通路识别昆虫病原微生物的分子机理，发掘该通路潜在的抗菌、抗病毒能力，为家蚕的基因工程改造和培育抗病虫害的优良品系提供理论依据。对家蚕Imd通路的了解也有助于发展针对其它鳞翅目害虫的生物防治方法，具有重要的理论和应用价值。

昆虫依靠先天免疫系统抵御病原微生物的侵袭，该系统通过各种模式识别受体识别特异的病原分子模式，诱导免疫反应表达抗菌肽。在果蝇中Toll和IMD信号通路是主要的两条调控抗菌肽表达的通路，其中IMD通路能够识别革兰氏阴性菌。IMD通路的肽聚糖识别受体PGRP-LC可以识别革兰氏阴性菌细胞壁中的肽聚糖，活化下游信号分子IMD，FADD，DREDD等，最终激活NFkappaB家族的转录因子Relish，诱导抗菌肽的表达。家蚕中也存在着类似的信号通路，预示着家蚕中也有果蝇PGRP-LC和IMD的同源蛋白存在。为了鉴定家蚕中的相关同源蛋白，并分析其功能，我们开展了以下研究：（1）通过序列比对，从GenBank和家蚕基因组数据库中筛选出PGRP-LC和IMD的同源序列（分别命名为BmPGRP-L1和BmIMD）；（2）对氨基酸序列特征、功能域进行分析，通过与其它昆虫中的同源序列的联配构建系统进化树；（3）将BmPGRP-L1的胞外区编码序列克隆至pET30原核表达载体，表达纯化带有6xHis标签的重组蛋白，并获得兔抗血清；（4）分析BmPGPR-L1和BmIMD在幼虫不同组织中的表达水平，以及受微生物刺激诱导的情况；（5）克隆BmPGRP-L1和BmIMD的全长或缺失片段到pAC5.1载体，在果蝇S2细胞中过表达，检测对几种果蝇抗菌肽基因的激活；（6）通过注射抗血清封闭BmPGRP-L1的胞外区，检测抗菌肽的表达是否受影响；（7）通过酶联免疫吸附试验检测重组BmPGRP-L1对革兰氏阴性菌和阳性菌肽聚糖的结合。本研究取得了以下结果：（1）序列分析显示BmPGRP-L1和BmIMD与它们在果蝇中的同源蛋白既有相似性又有不同之处；（2）BmPGRP-L1和BmIMD在幼虫的不同组织中表达量有显著差异，且它们可被微生物显著诱导；（3）封闭BmPGRP-L1受体的胞外区会影响多种抗菌肽的表达；（4）在果蝇S2细胞中过表达BmPGRP-L1和BmIMD的全长或片段会引起果蝇抗菌肽的显著上调；（5）重组表达的BmPGRP-L1蛋白体外能够结合两种纯化的肽聚糖。相关结果为阐明家蚕IMD通路的功能提供了数据基础。此外，为了更全面的了解鳞翅目昆虫免疫系统，本研究还增加了对小菜蛾PGRP和IMD，以及鳞翅目凝集素的研究等内容。