Fadd及Dredd基因在家蚕变态时期的信号通路研究

Silkworm is the insect of complete metamorphosis. During the metamorphosis period (from larval to adult), some larval tissue degenerated and disappeared completely. For example, the silkworm silk gland organ dramatically changes from the fifth instar to adult. Silk gland is the only organ for the synthesis and secretion of silk protein in Bombyx mrori. The silk gland begins to rapid growth and development from the 3rd day of the fifth instar. In a short time a large number of silk protein are synthesized and secreted into Silk gland cavity. Under the regulation such as hormones in the body, the silk gland rapidly degraded and disappeared in a short time from the end of the fifth instar to pupation. This process involves the programmed cell death (PCD) of silk gland cells. The project intends to study the silkworm silk gland process in metamorphosis and its main function of apoptosis pathway genes using the techniques and methods of RNA interference, overexpression, , flow cytometry, TEM detection, caspase-3 activation count testing, Electron microscopy etc., focusing on the function and regulation of BmFadd and BmDredd genes in cell or tissue degeneration and apoptosis of silkworm Bombyx mori, to explore the interaction and its downstream genes’ function in programmed cell signaling pathway. The project has an important significance for basic researches on the molecular mechanism of cell or tissue degeneration and apoptosis, but also provides a theoretical basis for improving cocoon production.

家蚕由幼虫到成虫的变态时期，某些幼虫组织完全退化消失，以家蚕丝腺为例，在五龄至熟蚕化蛹期间，家蚕的丝腺器官发生了剧烈的变化。家蚕丝腺是合成和分泌丝蛋白的唯一器官。从五龄第3天开始，丝腺器官迅速生长发育，在短时间内合成并分泌大量丝蛋白。五龄末期吐丝结束至化蛹后短时间内，在体内激素等作用下，丝腺器官迅速退化并消失，这一过程涉及到了丝腺细胞的程序性细胞死亡。本项目拟采用RNA干扰、过表达、流式细胞仪检测、TEM检测、caspase-3激活数检测、电镜检测等技术和方法，研究家蚕变态期丝腺的凋亡过程及其主要凋亡通路相关基因的功能，着重阐明家蚕BmFadd和及BmDredd基因在家蚕细胞或组织退化凋亡的程序性细胞信号通路中的功能及其下游基因间的互作和调控,对解析丝腺凋亡的分子机理及细胞或组织退化和凋亡的程序性细胞信号通路的基础性研究具有有重要意义，也为提高茧丝产量提供理论依据。

研究家蚕及丝腺主要凋亡通路相关基因的表达，对解析丝腺细胞及组织退化和凋亡的分子机理有重要意义。本研究主要内容及结果：1、家蚕细胞及组织凋亡通路相关基因BmDredd的研究。（1）克隆了BmDredd基因（2）细胞水平进行BmDredd的功能研究。发现凋亡细胞中BmDredd表达量升高，而RNA干扰BmDredd的表达则可以减小细胞凋亡率。构建了BmDredd过表达载体，结果发现过表达BmDredd可以引起细胞凋亡。（3）丝腺水平BmDredd功能研究。发现丝腺凋亡期间，BmDredd表达量升高，表明BmDredd与丝腺凋亡有着极重要的联系。注射dsRNA-BmDredd到家蚕丝腺可以延迟丝腺凋亡，在丝腺中过表达BmDredd引起过表达部位活性的升高，结果显示BmDredd参与和诱导丝腺凋亡。2、家蚕细胞及组织凋亡通路相关基因BmDaxx的研究。（1）克隆并鉴定了家蚕BmDaxx基因。（2）在BmN细胞系中进行BmDaxx基因的过表达和siRNA干扰实验。实验表明，当BmDaxx基因表达量增高时，细胞凋亡率也相应升高。（3）在BmN细胞和家蚕丝腺中定位了BmDaxx蛋白。家蚕丝腺中在吐丝36小时的丝腺凋亡最为激烈的时期相对于五龄3天时BmDaxx蛋白的表达量更多。3、家蚕细胞及组织凋亡通路相关基因BmFadd 研究。(1) 克隆并鉴定了家蚕BmFadd基因。(2) 实时荧光定量PCR发现，该基因在家蚕吐丝期及化蛹第一天的后部丝腺中的表达量达到峰值，至蛹期逐渐下降。这表明，BmFadd参与了家蚕变态发育过程中丝腺的退化。(3)采取紫外线和放线菌素D诱导细胞凋亡。当BmFadd基因的表达受siRNA干扰后，细胞凋亡率有不同程度的下降 (4) BmFadd-siRNA注射五龄第7天家蚕，透射电镜检测后部丝腺细胞的凋亡情况。结果表明BmFadd基因表达与细胞凋亡呈正相关。4、凋亡通路相关基因间的互作关系。（1）通过在BmN细胞中过表达和干扰BmDaxx基因，发现BmFadd和BmDredd的表达量变化趋势与BmDaxx的表达量变化趋势一致。推测BmDaxx、BmFadd 和BmDredd 在同一条凋亡通路间存在相互关系，并且为正相关。（2）用caspase抑制剂处理家蚕BmN细胞或注射家蚕，细胞凋亡率明显下降，BmDaxx，BmFadd 和BmDredd基因的表达量明显降低。