二肽重复蛋白poly-PR导致DNA损伤反应的机制研究

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a devastating motor neuron disease characterized by deficiency of upper motor neurons in the motor cortex and lower motor neurons in the spinal cord. A GGGGCC hexanucleotide repeat expansion in the C9ORF72 gene is the most common genetic mutation in ALS. The GGGGCC repeat expansion can be translated into five dipeptide repeat proteins (DPRs) in a repeat-associated non-ATG initiated manner, the arginine-rich poly-PR is reported to be the most toxic among the five DPRs. While the molecular mechanisms underlying the toxicity of poly-PR remain unclear, here our primary results show that poly-PR overexpression causes obvious DNA damage response (DDR) and inhibits the PAR formation mediated by PARP1, thus we infer that poly-PR-induced DDR and impaired DNA repair contribute to the pathogenesis. Combining with cell cultures, primary cortical neurons, and poly-PR transgenic mice models, further studies are needed to identify the molecular mechanism and small molecule compounds that are essential for poly-PR-induced DDR using molecular cell biology, biological chemistry, and behavioral tests, thereby providing scientific basis for the exploration of pathological mechanism and protective drugs.

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种严重的运动神经元疾病，主要表现为运动皮层区的上运动神经元和脊髓的下运动神经元损伤。近年的研究发现C9ORF72基因GGGGCC六核苷酸重复扩增是ALS遗传致病占比最高的因子，GGGGCC重复序列以非ATG依赖的形式翻译产生五种二肽重复蛋白，其中多聚脯氨酸-精氨酸（poly-PR）的毒性最为明显，但机制依旧不清楚。我们在预试验中发现poly-PR过表达可以导致DNA损伤反应，并且可以抑制PARP1介导的PAR糖基化形成，所以我们推测poly-PR引起的DNA损伤及其修复障碍参与了疾病发生。本项目通过利用体外细胞模型、小鼠原代皮层神经元模型以及本实验室的poly-PR转基因小鼠模型，采用生物化学、细胞生物学和在体实验，明确poly-PR导致DNA损伤反应的分子机制，并寻找可能保护的小分子化合物，为探索poly-PR致病机制和保护药物提供科学依据。

肌萎缩侧索硬化症是一种非常严重的神经退行性疾病，其病理改变主要表现为运动神经元的损伤以及相关的肌肉萎缩。C9ORF72基因突变产生的二肽重复蛋白poly-PR导致的细胞毒性最为明显，然而poly-PR致使细胞损伤的机制依旧不明。本项目通过综合应用生物化学、细胞生物学、生物物理学等学科方法探讨了poly-PR导致DNA损伤的分子机制。我们研究发现poly-PR分别在U2OS细胞系、原代皮层神经元、转基因小鼠中引起明显的DNA损伤反应。通过生物信息学分析已有的质谱结合数据，我们发现poly-PR与RNA结合蛋白FUS在细胞内与体外均能相互结合，并且在体外形成明显的相分离作用。进一步的结构域解析发现，FUS主要通过其C端的RGG/NLS序列介导两者的结合。Poly-PR与FUS的结合抑制了FUS在DNA损伤位点的定位，同时也抑制了FUS下游DNA修复蛋白XRCC1的招募作用。最后，我们通过过表达FUS蛋白缓解了poly-PR导致的DNA损伤效应，同时减缓了poly-PR诱导的细胞死亡作用。因此我们的结果表明poly-PR能够抑制DNA修复蛋白复合物的组装，强调了DNA修复过程在ALS疾病中的重要作用。