分选连接蛋白5在Wntless逆膜运输中的分子调节机制

The Wnt signaling molecules are secreted glycoproteins that form concentration gradients to play profound roles in embryogenesis. The aberrant Wnt signaling has been linked to childhood tumors, congenital heart and neurodevelopmental defects. Recently, a cargo protein Wntless (Wls) was identified to be seeential for the secretion of Wnt proteins. However, the molecular mechanisms underlying the Wls mediated Wnt secretion remains elusive. The long-term objective of this study is to understand how Wnt signaling is regulated. The specific approach is to examine how the Wnt secretion is regulated at the level of retrograde transport of Wls. Genetic studies strongly suggested that retrograde endosome-TGN transport of Wls by retromer complex is critical for Wnt secretion. Retromer protein Vps35 and Vps26 interact with Wls and are essential for the retrograde transpot of Wls but little is known about how SNX subcomplex of retromer is involved in this process. Interestingly, SNX5 phox domain has a unique structure and specific affinity for PtdIns(4,5)P2 although its role in retromer function is unknown. Recently a SNX5 interacting protein, TBC1D15, was identified in the laboratory that has Rab5-specific GAP activity. Overexpression of mutant SNX5 or TBC1D15 disrupted the retrograde trafficking of Wls. Thus, we hypothesize that, by specifically interacting with PtdIns(4,5)P2 and TBC1D15, SNX5 plays a critical role in the formation of SNX subcomplex and exit of the retromer-Wls complex from endosomes, thus regulating the recycling of Wls. Two specific aims are proposed to test the hypotheses: (1). To examine how the specific binding of SNX5 to PtdIns(4,5)P2 plays a critical role in the formation of SNX subcomplex during the retrograde transport of Wls; and (2). To examine how the interaction of SNX5 with TBC1D15 plays a critical role in tubular endosome-TGN transport of Wls.

Wnt信号分子是一类分泌型糖蛋白并通过形成细胞外浓度梯度而调控胚胎发育及正常细胞功能，其信号通路异常与许多重大疾病密切相关。近期研究指出膜蛋白Wntless(Wls)作为载体蛋白参与Wnt蛋白的细胞内膜运输过程，而Wls经逆膜复合体识别后从内质体向TGN的逆膜运输在Wnt的分泌中起关键作用。然而对逆膜复合体的形成和调节及其对Wls逆膜运输的作用却所知甚少。我们最近报道了内膜复合体中的成份蛋白之一SNX5具有独特的PX结构，并且与PtdIns(4,5)P2有特定亲和力；同时还发现了一个与其特异性结合的蛋白TBC1D15，且证实其特定的水解Rab5的GAP活性。过表达SNX5突变体或野生型TBC1D15都会影响Wls的逆膜运输。因此，本项目旨在通过研究SNX5 与多个大分子的相互作用及其在逆膜复合体介导的逆膜运输中的作用，从分子细胞水平上探讨Wls的逆膜运输的调节和在Wnt信号传递中的作用。

本课题原来提出的研究目标因为小额资助而修改为 1）证明SNX5与PtdIns(4,5)P2的特异性结合在Wls的逆膜转运中的逆膜复合体的形成起关健作用；2）证明SNX5与TBC1D15的特异性结合及在内体到TGN的Wls逆膜转运中的可能作用。在实验室实施的过程中因为该领域内新近发表的文献及实验室新的相关课题的进展，做了如下修正并获得了相应的成果，现有两篇文章正在撰写，会在近期发表，且IF总分会在4分以上，现将这些研究进展总结如下：.在课题获得小额资助前后，本领域有数个文献报道了Winless（Wls）的膜运输受SNX3而非SNX5的调节，如Lorenowicz 等通过用C. elegan 模式动物进一步证实了之前在果蝇实验中获得的有关SNX3在Wls逆膜运输中的作用[1-3]。此外，Alexandre等在果蝇模式动物模型中报道了 Win信号传导在发生发育中对Wls膜运输的依赖性相对较弱[4]，相反，此前数个文献报道了Wls在果蝇in vivo 的Wnt蛋白分泌中起重要作用而成为本课题的立体依据之一[5-7]，因此我们觉得继续探讨SNX5及经典逆膜复合体（SNX1-SNX5-Vps-26-29-35) 在Wls逆膜运输及如何调节Wnt的信号传导的分子机制（相对于in vivo在体实验）已部分失去生物学及临床医学意义，同时在对于理解逆膜运输的分子调节机制上Wls也失去作为靶点蛋白的角色，故决定转而用该小额度资助来发展实验室数个极有生物学意义及相关领域领先的课题，具体课题及进展如下：. 1）SNX5与神经突触囊泡转运蛋白的结合及其稳定膜蛋白表达及功能的分子机制；SNX5与VAChT特异性结合，SNX5敲减导致VAChT半衰期缩短，进一步研究证实SNX5也调节VAChT的突触囊泡靶定位，可能与蛋白的内体循环及蛋白稳定性有关。该课题已基本结束，我们正在撰写文章，会在近期送出。. 2）帕金森氏病（PD）相关基因对逆膜运输的影响及其致病机制；. 3）新的逆膜运输研究的细胞生物学模型的建立及运用；.根据本实验室长期使用Tac 嵌合蛋白的优势，我们使用人CI-MPR的C-末端建立了3HA-Tac-M6PR嵌合蛋白以便动态跟踪膜表面蛋白内吞后的逆膜运输，从而研究更符合人的细胞逆膜运输的分子机制及与疾病的关系。该工作符合预期结果，文章将在近期内投稿并争取在3月初接受发表。