大肠杆菌5-氨基乙酰丙酸穿膜运输的分子基础

5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）是血红素等四吡咯化合物合成必需前体，可用于光动力癌症治疗和农作物生长促进剂。利用大肠杆菌生产高附加值的ALA时，胞内过量积累的ALA对细胞有毒害作用。已知大肠杆菌利用Dpp系统摄入ALA，但尚未开展对ALA外排系统的研究。本研究利用大肠杆菌单基因突变株库Keio collecction通过高通量平台筛选对ALA耐受性发生变化的突变株，寻找参与ALA外排以及Dpp系统外的摄入蛋白，并解析相关蛋白的运输机制。ALA运输蛋白的发现不仅可以加深对细菌运输ALA系统的理解，同时也为改造大肠杆菌生产ALA提供了新思路。

5-氨基乙酰丙酸（ALA）是血红素等四吡咯化合物合成必需前体，可用于光动力癌症治疗和农作物生长促进剂。研究发现胞内过量积累的ALA对哺乳动物细胞有毒害作用，因此在微生物过量合成ALA的生产应用中可能也存在类似问题。已知大肠杆菌利用Dpp系统摄入ALA，但目前尚没有关于ALA外排系统的研究和报道。本工作结合分子生物学、代谢工程和系统生物学的方法，对大肠杆菌中ALA的转运机制进行系统解析，取得的成果主要包括以下几个方面：.（1）更正了以往文献中认为外加低浓度ALA（2-3g/L)抑制大肠杆菌生长的观点，实际主要是由于ALA盐酸盐制品对培养基pH的影响，进而造成对细胞生长的抑制。在合适的条件下野生型大肠杆菌可以耐受30 g/L以上的ALA。.（2）构建获得了评价ALA运输蛋白的测试菌株：本工作通过加强ALA合成能力、强化合成前体供给、减少下游代谢等策略，获得多株可以过量合成ALA的菌株，为研究ALA转运蛋白，特别是外排蛋白提供了优秀的评价菌株，也为ALA的生物法生产提供了有竞争力的菌株，有望推动ALA在农业和医药领域的应用。同时，本工作还发现了新的ALA合成酶同工酶以及影响ALA脱水酶功能的重要位点，加深了对血红素合成途径的认识。.（3）发现了一种新的参与ALA外排的转运蛋白EamA。本工作结合大肠杆菌膜转运蛋白的功能和分类，研究了多种可能参与ALA转运的膜运输蛋白，发现转运蛋白EamA参与ALA外排，与近期报道的RhtA相比转运效果更好。EamA敲除的菌株ALA产量下降了23%，而EamA表达强化的菌株ALA外排增强22%，5 L发酵罐中产量达到了21.7 g/L，远远超过了现有报道生产菌株的最高水平（9.4 g/L）。.（4）初步探索了利用转录组分析确定ALA转运蛋白的可能性。通过大肠杆菌响应胞外ALA的转录组分析，发现胞外高浓度ALA可以引起细胞内100多种膜转运蛋白在转录水平上发生明显变化，进一步的深入分析还在进行中。.本工作加深了对ALA转运系统的认识，为ALA和血红素合成及下游代谢方面的研究提供了良好的素材，同时也为生物法生产ALA奠定了重要的基础。